主要包括以下4個(gè)基本步驟：

樣品制備

電泳分離

蛋白的膜轉(zhuǎn)移

免疫雜交與顯色――蛋白檢測

溶液和試劑

1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)

Modified RIPA buffer

Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM

1X SDS 樣品緩沖液

62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT,0.01% w/v溴酚藍(lán)

轉(zhuǎn)移緩沖液

25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)

10X Tris緩沖鹽 (TBS)

準(zhǔn)備1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl調(diào)pH為 7.6

脫脂奶粉或BSA

甲醇

TBS/T緩沖液

1X TBS, 0.1% Tween-20

封閉緩沖液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脫脂奶粉或BSA

一抗的稀釋

1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脫脂奶粉(單抗)

Note:

一般來說, BSA被推薦用于多克隆抗體，脫脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比。抗體的稀釋度參考抗體說明書或根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定。

預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測轉(zhuǎn)膜的效率

樣品制備

原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

1．培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。

2．棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。

3．加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 ?l /w或 75 cm2 plate, 500-1000?l/瓶)，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。

注意：冰上操作。

4．超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5．煮沸樣品5 minutes。

6．離心12000g, 5 min，取上清。

7．電泳分離：上樣15?l~20 ?l 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。

如要定量檢測某蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100mm dish/150 cm2 flask)裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min（4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。

注意：

一般上樣20~30 ?g已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100?g，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測方法。
電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法）轉(zhuǎn)膜雜交膜的選擇是決定 Western blot 成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的 NC 膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用 0.45?m 和 0.2?m 兩種規(guī)格的 NC 膜。大于 20kD 的蛋白可用 0.45?m 的膜 ，小于 20kD 的蛋白就要用 0.2?m 的膜了，如用 0.45?m 的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。

以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。

將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。

注意：

1.如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。

2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如 用 PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。

3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿3 層濾紙膠膜3 層濾紙海綿，每層放好 后 ，用試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。

4.將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。

注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。

5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜

免疫雜交與顯色

1．用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。

2．置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。

3．15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

4．加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動(dòng)。

5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

6．加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。

7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

8．15 ml TBS洗1次。

9．蛋白檢測(顯色法或發(fā)光法，按相應(yīng)試劑說明操作)。

注意事項(xiàng)：

1．操作中戴手套，不要用手觸膜。

2．PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過5秒。

3．如檢測小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2?m的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。

4．某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。

5．關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。

6．如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進(jìn)行蛋白染色。

7．如要同時(shí)檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。