一、測定用乙醇固定的DNA的含量

1、培養(yǎng)細(xì)胞的DNA含量的測定

制備單細(xì)胞懸液于 200μl 的 PBS 緩沖液中；加入 2ml 預(yù)冷的 70%乙醇，4℃保存；附細(xì)胞固定的一般步驟

1)取單細(xì)胞懸液 1～2×106 個細(xì)胞于 PBS（PH=7.2）緩沖液中；

2)300g 離心 5 分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；

3)重懸細(xì)胞于 0.5ml PBS 緩沖液中；

4)將細(xì)胞懸液放置于 2～3ml 冷 70%乙醇中，混勻，保存于 4℃，至少 30 分鐘 。在 4℃條件下可保存 2~3 周。

注意：

根據(jù)實驗的要求，固定劑也可選用 1～3%多聚甲醛；

將乙醇作為固定劑時，乙醇應(yīng)預(yù)冷至 0～4℃；

細(xì)胞在固定時，固定劑應(yīng)緩慢滴入細(xì)胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免細(xì)胞成團(tuán)（特別是用乙醇固定時）。

300g 離心 5 分鐘，去上清，再重懸于 400μl PBS 中；

顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附，須再用篩網(wǎng)過濾；

加入 PI（含 Rnase），避光孵育 30 分鐘；上機(jī)檢測。

2、新鮮組織的DNA含量的測定

1)用 200mg 濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液；

2)500g 離心 5 分鐘；

3)棄上清，重懸于 10ml 染色-去污劑中；

4)再過濾，用 200 目的篩網(wǎng)或 70~80μm 的篩網(wǎng)過濾；

5)上機(jī)檢測。

3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測定

1)從石蠟包埋切取切片 50 μm 厚，2~3 片，制成單細(xì)胞懸液；

2)用 PBS 緩沖液洗滌，500g 離心 5 分鐘，棄上清；

3)加入 PI 液 1ml 室溫避光 30 分鐘；

4)調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106/ml；

5)上機(jī)檢測。

二、細(xì)胞凋亡檢測及相關(guān)分子檢測

1、細(xì)胞DNA含量分布（由細(xì)胞DNA降解方式檢測細(xì)胞凋亡）

收集已固定的單細(xì)胞懸液約 5×105~1×106/ml；

離心除去固定液，3ml PBS 重懸細(xì)胞;

1500rpm 離心，5 分鐘 ，棄去 PBS；

加 PI 染液 1ml，室溫避光 20 分鐘；

調(diào)整細(xì)胞濃度 5×105/ml；

上機(jī)檢測。

2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細(xì)胞凋亡

1)常 規(guī) 制 備 單 細(xì) 胞 懸 液 , 用 PBS 洗 兩 次 .( 若 為 全 血 要 先 溶血),取約 5×106 個細(xì)胞，1500rpm 離心,棄上清,用 400μl 1×Binding Buffer 重懸 ；

2)分成 a、b、c、d、e 五管，每管約 1×106 個細(xì)胞a)陰性對照，不加任何試劑；b)陽性對照,加 2%多聚甲醛固定 30 分鐘,加 AnnexinV 5μl,室溫 10min,用1×Binding Buffer 洗一次,棄上清再加 190μl 緩沖液、10μl PI 避光 15 分鐘c)加 10μl PI，避光孵育 15 分鐘；d)加 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 15min；e)加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 5min；

3)每管各加 400μl 1×Binding Buffer。

4)上機(jī)檢測。

注意:

a. 操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞；

b. 操作時注意避光；

c. 反應(yīng)完畢后盡快檢測，最好在一小時內(nèi)檢測。

3、用單克隆抗體 APO2.7 檢測細(xì)胞凋亡

1)放置 0.5~1×106個細(xì)胞到試管中；

2)室溫離心 200g，6min；

3)棄上清，加入 100μl 冷的（ 4℃）在 PBSF 溶液中含 100?g/ml 的digitonnin，輕輕地重懸細(xì)胞，在冰上孵育 20min；

4)加入 2ml 冷的（4℃）PBSF 液，室溫離心 200g，6min；

5)棄上清，加入 20μl PE 標(biāo)記的 Apo2.7 單克隆抗體和 80μl PBSF 液，用vortex 輕輕震蕩，室溫避光孵育 15 分鐘；

6)加入 2ml PBSF 液，室溫離心 200g，6min；

7)棄上清，加入 1ml PBSF 液重懸細(xì)胞；

8)避光保存，直到流式細(xì)胞儀檢測。

PBSF：含 2.5% FCS（v/v）和 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。

三、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA周期分析

1、方法：同 DNA 含量檢測

2、注意：

單細(xì)胞濃度應(yīng)約 106/ml，以免影響檢測的 CV 值和檢測結(jié)果；

制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量（如細(xì)胞是否聚集或過多碎 片 ），以保證得到足夠的細(xì)胞含量；

醛類固定會影響 PI 與核酸的結(jié)合。

四、免疫熒光標(biāo)記法

1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測法間接標(biāo)記法

1)制備單細(xì)胞懸液；

2)細(xì)胞計數(shù)，取出 1×106 個細(xì)胞于試管中；

3)用臺盼藍(lán)染色計活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù) >90～95%；

4)在試管中加入一抗，（劑量按照說明書的要求），孵育 30～60 分鐘；

5)PBS 洗滌 1～2 次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清；

6)加入二抗，孵育 20～30 分鐘；

7)PBS 洗一次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

8)加 300μl PBS，上機(jī)檢測(若不能及時上機(jī)檢測，可加 1ml 1%多聚甲醛固定，可放置 1 周)。

直接標(biāo)記法

①～③同間接標(biāo)記法

④在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻，孵育 30 分鐘；

⑤用 PBS 洗 2 次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

⑥加 300μl PBS(PH=7.4)，上機(jī)檢測。

2、細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法間接免疫熒光標(biāo)記法

1)取已制備好的單細(xì)胞懸液，用1～3%的多聚甲醛固定 30 分鐘（也可 4℃保存過夜）；

2)用 PBS 洗兩次，棄上清；

3)細(xì)胞膜打孔，加入 0.1%皂素 200ul，室溫 10 分鐘；

4)用 PBS 洗滌兩次；5)加入第一抗體，室溫 30～60 分鐘，或 4℃過夜，同時須設(shè)陰性對照或同
型對照管；

6)用 PBS 洗滌兩次；

7)加入二抗（熒光標(biāo)記的抗體）室溫 20 分鐘，避光；

8)用 PBS 洗滌 1～2 次，棄上清；

9)重懸細(xì)胞于 500ulPBS 中，上機(jī)檢測。

直接熒光標(biāo)記法

①～⑤同間接熒光標(biāo)記法；

加入熒光素標(biāo)記好的抗體，避光 30 分鐘（同時做同型對照管）；

用 PBS 洗滌１～２次，棄上清；

加 300ul PBS 上機(jī)檢測。

細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法（直標(biāo)法）

1)取出已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液 1×10 6 個細(xì)胞于試管中；

2)用 PBS 洗滌兩次；

3)加入用熒光素標(biāo)記的抗體來標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原，同時加上陰性對照管，室溫孵育 20 分鐘；

4)在試管中加入 1％～3％多聚甲醛 1ml，固定 30 分鐘；

5)PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘，棄上清;

6)打孔，加入 0.1％皂素 200μl 室溫 10 分鐘;

7)用 PBS 洗滌兩次，棄上清;

8)加入用熒光素標(biāo)記的抗體，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原（標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫 20 分鐘孵育;

9)用 PBS 洗一遍棄上清；

10) 用 300μlPBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測

五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點注意事項：

1、對照組的設(shè)置：

在流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量都是相對值，不是絕對值。如需知道絕對值時必須設(shè)置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。

（1）、陰性對照的設(shè)置

在實驗過程中，如做間接標(biāo)記法，可設(shè)置與一抗無關(guān)的實驗，即在實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對照管，作為陰性對照。在實驗過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可設(shè)置理論上的陰性細(xì)胞作為陰性對照管，實驗過程及步驟與實驗組務(wù)必相同。（做間接標(biāo)記法時 ，同樣也可同時設(shè)置“陰性細(xì)胞”的陰性對照管作為陰性對照。在實驗過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可將實驗組細(xì)胞，取一管，加上與實驗抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。

（2）、陽性對照的設(shè)置：

在實驗過程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實驗，應(yīng)設(shè)置陽性對照組，其設(shè)置方法與陰性對照設(shè)置相同。

2、幾點建議：

1)在實驗過程中，在保證實驗的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量減少實驗工序和過程。由于間接標(biāo)記法的工序多，實驗過程長，如再加之操作的不熟練 ，細(xì)胞更容易丟失和受損，而造成實驗結(jié)果的誤差。因此，在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量做直接標(biāo)記法而不去做間接標(biāo)記法，以保證實驗的真實性和準(zhǔn)確性。

2)建議送檢細(xì)胞一定要足夠量，一般要求 1×106 個細(xì)胞。不要過少。因為，如細(xì)胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數(shù)，結(jié)果也不可信。細(xì)胞量也不宜過多，因細(xì)胞量太多加入的抗體或染料相對不足，結(jié)果也由此受影響。

3) 同一種細(xì)胞需同時做雙標(biāo)記時，須做雙標(biāo)記的同型對照，且兩種抗體所標(biāo)記的熒光顏色務(wù)必不同。