染色質(zhì)免疫共沉淀是一種強(qiáng)力的手段，來(lái)聯(lián)系蛋白質(zhì)或其修飾位點(diǎn)與基因組的關(guān)系。染色質(zhì)分離并用特異性抗體判斷是否與特異性DNA 序列相結(jié)合。染色質(zhì)免疫沉淀法亦可用來(lái)檢測(cè)目的位點(diǎn)在基因組中的時(shí)空分布（用芯片或DNA 測(cè)序）。本操作規(guī)程詳細(xì)闡述了交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀(X-ChIP) 實(shí)驗(yàn)的具體步驟。

1.交聯(lián)和細(xì)胞收集

(用甲醛來(lái)使蛋白質(zhì)和DNA 相交聯(lián)。交聯(lián)的時(shí)間很關(guān)鍵，因此需優(yōu)化。建議樣本交聯(lián)的時(shí)間為2-30 分鐘。

過(guò)度的交聯(lián)可降低抗原的可結(jié)合性和超聲的效率。抗原的表位也會(huì)被遮蓋。甘氨酸可抑制甲醛的作用并終止交聯(lián)反應(yīng)。)

1.1 取2 個(gè)150cm2 培養(yǎng)皿的融合細(xì)胞(每皿細(xì)胞數(shù)約1 X 107 - 5 X 107 個(gè))。向培養(yǎng)基中滴加甲醛以使蛋白和DNA 相交聯(lián)，甲醛的終濃度為0.75%（體積百分比），室溫下輕輕搖動(dòng)10 分鐘。

1.2 加入甘氨酸至終濃度為125mM，輕輕振蕩孵育5 分鐘。

1.3 用10ml 冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次。

1.4 刮下細(xì)胞并用5ml 冷PBS 收集，轉(zhuǎn)移至一個(gè)50ml 離心管中。

1.5 用3ml PBS 洗滌培養(yǎng)皿，收集剩余細(xì)胞至50ml 離心管中。

1.6 1000g 離心5 分鐘

1.7 小心吸棄上清液，用FA 裂解緩沖液重懸沉淀(每1 X 107 個(gè)細(xì)胞加750μl)

(用細(xì)胞懸液實(shí)驗(yàn)時(shí)，起始細(xì)胞量為1x107- 5x107 個(gè)細(xì)胞，并按照第一部分的步驟加入體積百分比0.75% 的甲醛和甘氨酸。

離心沉淀細(xì)胞（5 分鐘, 1000g）。用冷PBS 洗滌3 次，用FA 裂解液重懸沉淀（每1 X 107個(gè)細(xì)胞加750μl）。然后轉(zhuǎn)到步驟2.1。)

2. 超聲

當(dāng)使用組織來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)（見(jiàn)步驟6.2），要得到單細(xì)胞懸液，應(yīng)從此步超聲處理開(kāi)始。

2.1 將裂解液超聲處理以使DNA 斷裂成約500-1000bp 的片段。不同的細(xì)胞系需要不同的超聲時(shí)間，因此需分別進(jìn)行優(yōu)化。

交聯(lián)后的裂解液應(yīng)進(jìn)行超聲處理，并優(yōu)化得到最佳條件。取部分樣本按照步驟3 進(jìn)行DNA 分離。

片段大小應(yīng)按照?qǐng)D1 所示，用質(zhì)量百分比1.5% 的瓊脂糖凝膠分析。

2.2 超聲處理后，4°C，8000g 離心30 秒使細(xì)胞碎片沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。此染色質(zhì)溶液將用于步驟4的免疫沉淀（IP）。

2.3 每個(gè)超聲后的樣本均取50μl，此樣本為抽樣樣本，用于定量DNA 濃度（見(jiàn)步驟3），并作為PCR 的對(duì)照樣本。

(超聲后的染色質(zhì)可在液氮中速凍，在-80°C 中可保存2 個(gè)月。應(yīng)避免反復(fù)凍融。)

圖1. U2OS 細(xì)胞分別超聲5、10、15 和20 分鐘。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，所得片段大小逐漸減少。超聲15 分鐘后可得到最適片段大小。

注意：超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使核小體與DNA 的交聯(lián)斷裂，因此條帶大小不應(yīng)低于200bp。

3. DNA濃度測(cè)定

3.1 抽樣樣本用來(lái)測(cè)定DNA 濃度，為后續(xù)IP反應(yīng)提供數(shù)據(jù)。用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（加70μl 洗提緩沖液，轉(zhuǎn)至步驟3.2a）或酚:氯仿（加350μl 洗提緩沖液，轉(zhuǎn)至步驟3.2b）來(lái)純化DNA。

3.2a 加入2 μl RNA 酶A (0.5 mg/ml)。置于65°C 恒溫振蕩4-5 小時(shí)（或過(guò)夜）以解交聯(lián)。按照PCR 產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)純化DNA。用DNA 純化試劑盒來(lái)純化DNA 時(shí)，RNA 濃度過(guò)高會(huì)干擾DNA 的純化過(guò)程，因此樣本中應(yīng)加入RNA 酶A 處理。否則純化柱吸附飽和時(shí)產(chǎn)物會(huì)大大減少。

3.2b 加入5μl 蛋白酶K (20mg/ml)。65°C 恒溫振蕩4-5 小時(shí)（或過(guò)夜）以解交聯(lián)。酚:氯仿抽提DNA，乙醇沉淀中加入10μl 糖原(5 mg/ml)。用100μl 水重懸沉淀。樣本可凍存于-20°C 冰箱中。樣本用蛋白酶K處理，可使脂肪與芳香族氨基酸的羧基鄰近的肽鍵斷裂。破壞蛋白質(zhì)和DNA 的交聯(lián)可幫助DNA的純化。

3.3 DNA 濃度測(cè)定: 取5μl 純化DNA，加入裝有995μl TE的離心管中，200 倍稀釋?zhuān)瑴y(cè)定OD260。根據(jù)公式DNA 濃度（μg/ml）=OD260 x10,000，計(jì)算每毫升染色質(zhì)溶液中DNA的濃度。

4. 免疫沉淀

4.1 使用步驟2.2 中得到的染色質(zhì)溶液繼續(xù)此操作。建議每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)DNA 含量約為25μg。每個(gè)樣本用RIPA 緩沖液1:10 稀釋。應(yīng)設(shè)一個(gè)抗體對(duì)照和一個(gè)僅加磁珠的對(duì)照。

4.2 除對(duì)照外，其余樣本中均加入一抗。事先應(yīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳的抗體加入量。一般來(lái)說(shuō)，每25μg DNA 加入1-10μg 抗體。

4.3 所有樣本均加入20μl 的蛋白A/G 磁珠（預(yù)吸附了鮭魚(yú)精DNA 和牛血清白蛋白，見(jiàn)步驟4.3a），進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，4°C旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。

4.3a 蛋白A/G 磁珠與鮭魚(yú)精DNA 混合液的制備：如果使用蛋白A 和蛋白G 兩種磁珠，應(yīng)將其等體積混合，并用RIPA 緩沖液洗滌3 次。

吸棄RIPA 緩沖液，加入鮭魚(yú)精DNA 至終濃度75ng/μl，同時(shí)加入牛血清白蛋白至終濃度0.1μg/μl。加入等體積RIPA 緩沖液，

常溫旋轉(zhuǎn)孵育30 分鐘。用RIPA 緩沖液洗滌一次，然后加入等體積RIPA 緩沖液。

應(yīng)使用蛋白A 磁珠、蛋白G 磁珠或兩種混合物。61 頁(yè)第9.5 部分的表中列出了兩種磁珠對(duì)不同種屬免疫球蛋白的不同親和性。

4.4 將蛋白A/G 磁珠離心，2000g 1 分鐘，棄上清。

4.5 用1ml 洗滌緩沖液洗滌磁珠3 次。2000g 離心1 分鐘。

4.6 用末次洗滌緩沖液洗1 次。2000g 離心1 分鐘。

(如果背景過(guò)高，則應(yīng)增加洗滌次數(shù)。或者，在步驟4.2 之前將超聲處理后的染色質(zhì)與蛋白A/G 磁珠共孵育1 小時(shí)，以去除背景。

此步將消除與磁珠的非特異行結(jié)合。將上清液（超聲處理的染色質(zhì)）轉(zhuǎn)移至一個(gè)新管中，然后按照前述步驟4.2 將抗體與磁珠孵育。)

5. 洗滌和解交聯(lián)

5.1 洗滌DNA：向蛋白A/G 磁珠中加入120μl 洗滌緩沖液，30°C 旋轉(zhuǎn)15 分鐘。

5.2 2000g 離心1 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。樣本可于-20°C 保存。

5.3 純化DNA 可用PCR 純化試劑盒（見(jiàn)步驟3.2a）或酚:氯仿（加280μl 洗提緩沖液，然后參照步驟3.2b）法進(jìn)行。

5.4 DNA 可用實(shí)時(shí)PCR 進(jìn)行定量檢測(cè)。可用實(shí)時(shí)PCR 儀自帶的軟件進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。或者，也可以使用在線(xiàn)設(shè)計(jì)工具進(jìn)行設(shè)計(jì)。

6. 組織免疫沉淀中染色質(zhì)的制備

此步驟描述了從組織中制備染色質(zhì)，以用于后續(xù)的染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)。每個(gè)免疫沉淀/抗體反應(yīng)推薦使用組織30mg，但組織使用量可根據(jù)實(shí)際進(jìn)行調(diào)整。每種組織的用量依據(jù)組織蛋白豐度、抗體親和力和交聯(lián)效率而定。每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)最適染色質(zhì)的量為5-15μg。每次交聯(lián)免疫沉淀反應(yīng)之前，需根據(jù)不同組織類(lèi)型確定具體的染色質(zhì)需要量。應(yīng)先按照下述方法制備染色質(zhì)溶液，

再進(jìn)行交聯(lián)免疫沉淀反應(yīng)。所有溶液中均應(yīng)添加蛋白酶抑制劑（10μl/ml 的PMSF，1μl/ml 的抑肽酶和1μl/ml 的亮肽素，溶于PBS 中）。
本部分摘自Henriette O’Geen, Luis G. Acevedo 和Peggy J. Farnham 提供的操作規(guī)程。
6.1 交聯(lián)

(冰凍組織應(yīng)置于冰上融化（根據(jù)組織用量的不同，此過(guò)程可能需要幾個(gè)小時(shí)不等）。注意，冰凍組織融化時(shí)溫度不能過(guò)高，以免蛋白酶活化使組織降解。操作過(guò)程中樣本要一直置于冰上，所有操作均應(yīng)迅速完成，以使其處于融化狀態(tài)的時(shí)間最短。組織切塊時(shí)要在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，其下要放置一塊干冰。)

6.1.1 用刀片將冰凍或新鮮組織切成小塊（1-3mm3）

6.1.2 取一個(gè)空的15ml 錐形離心管，稱(chēng)重，放入組織后再次稱(chēng)重，計(jì)算組織重量。

6.1.3 在通風(fēng)櫥中配制交聯(lián)所用溶液。每克組織加10ml 磷酸鹽緩沖液。加入終溶度1.5%（v/v）的甲醛，室溫旋轉(zhuǎn)15 分鐘。

6.1.4 加入甘氨酸至終濃度0.125M，以終止交聯(lián)反應(yīng)。繼續(xù)室溫旋轉(zhuǎn)5 分鐘。

6.1.5 組織樣本離心，4°C 720 rpm，離心5 分鐘。

6.1.6 吸棄培養(yǎng)基，用10ml 冰上預(yù)冷的PBS 洗滌。4°C 720 rpm，離心5 分鐘，棄掉洗滌緩沖液。

(此步所得組織可以用液氮速凍，然后保存于-80°C。應(yīng)避免反復(fù)凍融。

如果隨后使用，可以用冷PBS 重懸組織，每克組織加10ml，冰上放置。)

6.2 組織降解

應(yīng)用Becton Dickinson 生產(chǎn)的Medimachine（中型研磨器）處理得到單細(xì)胞懸液。每克組織使用2 個(gè)中號(hào)錐形研磨管(50μm)。

6.2.1 將1ml 槍頭的末端剪掉，使吸頭口增大。

6.2.2 50-100mg（3-4 塊）的組織用1ml PBS 重懸。

6.2.3 將溶液加入錐形研磨管中，研磨2 分鐘。

6.2.4 將18 號(hào)鈍圓的針頭連接到1ml 注射器上，將其插入錐形研磨管中收集細(xì)胞。將細(xì)胞加入一個(gè)錐形管中，冰上放置。

6.2.5 重復(fù)步驟2.2 直到所有組織均處理完。

6.2.6 鏡下觀(guān)察細(xì)胞懸液，以確定得到的是單細(xì)胞懸液。如果需要進(jìn)一步研磨，可在組織中加入更多的PBS，重復(fù)步驟2.2 到2.5 直至所有組織均研磨成均一的懸液。

6.2.7 將細(xì)胞離心，1000rpm，4°C，離心10 分鐘。估算細(xì)胞沉淀的體積以備下一步操作。

6.2.8 小心吸棄上清液，用FA裂解緩沖液重懸沉淀（每1x107 個(gè)細(xì)胞加入750μl）。

6.2.9 從第2 階段（超聲處理）開(kāi)始，繼續(xù)進(jìn)行交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)。