無(wú)特異性抗體對(duì)照時(shí)出現(xiàn)背景過(guò)高

與蛋白A 或G 非特異性結(jié)合

應(yīng)采用預(yù)清除處理，即在加入抗體前，將裂解的樣本與磁珠混合1小時(shí)然后分離使用。

染色質(zhì)免疫沉淀所用緩沖液被污染

裂解液和洗滌緩沖液要新鮮配制。

某些蛋白A 或G 磁珠本身會(huì)產(chǎn)生很高的背景

某些蛋白A 或G 磁珠會(huì)有很高的背景。要找到一個(gè)合適的供應(yīng)商，所提供的產(chǎn)品應(yīng)在非特異性對(duì)照樣本中得到背景最低最干凈的結(jié)果。

結(jié)合區(qū)域過(guò)大使得背景過(guò)高分辨率過(guò)低

片段過(guò)大

針對(duì)不同的細(xì)胞系，應(yīng)優(yōu)化DNA 片段的大小。超聲時(shí)間和酶孵育時(shí)間均應(yīng)調(diào)整。建議DNA 片段不要超過(guò)1.5kbp。如果用酶消化染色質(zhì)，會(huì)得到175bp 大小的單核苷酸酶。

信號(hào)過(guò)低

染色質(zhì)片段過(guò)小

要得到小于500bp 的染色質(zhì)片段時(shí)，不需進(jìn)行超聲處理。太小的片段會(huì)使核小體被誤認(rèn)為核小體間的DNA 而被消化掉。如果進(jìn)行末端染色質(zhì)免疫沉淀，通常酶消化法即能得到所需大小的染色質(zhì)片段。

交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀時(shí)交聯(lián)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

用甲醛交聯(lián)10-15 分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液洗凈，接著需要加入甘氨酸以終止甲醛的作用。過(guò)度交聯(lián)可能會(huì)降低表位的可結(jié)合度從而減少抗體的結(jié)合。

原材料不足

建議每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)用25μg 染色質(zhì)

免疫沉淀中抗體不足

建議開始時(shí)加入抗體量為3-5μg。如果未檢測(cè)到信號(hào)，可增加抗體量至10μg。

特異性抗體結(jié)合受阻礙

在洗滌緩沖液里氯化鈉濃度不要高于500mM，否則濃度過(guò)高將阻礙特異性抗體結(jié)合

細(xì)胞裂解不充分

建議用RIPA 緩沖液來(lái)裂解細(xì)胞

目標(biāo)區(qū)域無(wú)足夠的抗體

目標(biāo)區(qū)域無(wú)表位。應(yīng)有陽(yáng)性對(duì)照抗體，以確認(rèn)操作過(guò)程無(wú)誤，如H3K4me3 用于活化的啟動(dòng)子，或者H3K9me3 抗體用于異染色質(zhì)位點(diǎn)。

有些單抗不適合做交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀

單抗識(shí)別的表位可能會(huì)在交聯(lián)過(guò)程中被掩蓋，而阻礙位點(diǎn)識(shí)別。建議用多克隆抗體，可識(shí)別多個(gè)表位，這樣就增加了免疫沉淀目標(biāo)蛋白的幾率。

用錯(cuò)了抗體親和性磁珠

蛋白A 和G 是細(xì)菌來(lái)源蛋白質(zhì)，其對(duì)不同種的免疫球蛋白的親和性不同。請(qǐng)使用特異性的親和基質(zhì)。建議使用混合好的蛋白A 和蛋白G 瓊脂糖。

免疫沉淀DNA 時(shí)PCR 擴(kuò)增的問(wèn)題

反應(yīng)后包括無(wú)模板的陰性對(duì)照在內(nèi)均出現(xiàn)很高的信號(hào)

實(shí)時(shí)PCR 所用試劑被污染。建議使用儲(chǔ)備液來(lái)新鮮配制溶液。

樣本中無(wú)DNA 擴(kuò)增

使用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照/抽樣DNA 以確定樣本中引物均有效。