BPS Bioscience：LysA 通用PAR化測定試劑盒

發(fā)布者：艾美捷科技發(fā)布時間：2024-07-17

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聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的抑制劑已經(jīng)改變了癌癥治療的游戲規(guī)則，證明了靶向DNA損傷反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)互補途徑的合成致死藥物的潛在功效。然而，在完整細胞中評估聚ADP核糖基化是困難的，減緩了候選藥物的開發(fā)。BPS Bioscience的LysA?通用PAR化測定試劑盒可定量并比較細胞提取物中存在的PAR化蛋白的量，從而確定培養(yǎng)細胞中化合物的功效，并彌合生化測定和動物試驗之間的差距。在這里，我們討論了該測定的原理，并提供了如何在完整細胞中評價PARP或PARG抑制劑的實驗示例。

背景

ADP-核糖單元對蛋白質(zhì)的添加是參與細胞過程如DNA修復(fù)、染色質(zhì)重塑和基因表達控制的重要翻譯后修飾。它主要發(fā)生在與DNA損傷反應(yīng)（DDR）相關(guān)的蛋白質(zhì)中。這種添加有兩種形式：單ADP核糖基化（添加單個ADP核糖單元，也稱為MAR化）和聚ADP核糖基化（以線性或分支形式添加多個單元），也稱為PAR化。

各種形式的單ADP核糖基化和多ADP核糖基化的圖示

圖1：各種形式的單ADP核糖基化和多ADP核糖基化的圖示。在下述測定中使用的抗PAR抗體識別各種形式的聚ADP核糖基化，如藍色框所示。

PAR化由稱為聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的17種酶的家族協(xié)調(diào)，其中PARP 1至PARP 5催化PAR化，而其他PARP執(zhí)行MAR化（1）。 PARP 1、PARP 2和PARP 3具有嚴(yán)格的DNA依賴性。 PARP 1是主要的參與者，因為它負責(zé)高達80%的總細胞PARylation（1）。 PARP 1和PARP 2主要參與DNA修復(fù)，協(xié)調(diào)DDR網(wǎng)絡(luò)。 PARP 2還控制表觀遺傳學(xué)、增殖、炎癥和發(fā)育（5，6）。相反，PARP 1改變轉(zhuǎn)錄并在DNA損傷無法修復(fù)時誘導(dǎo)細胞凋亡。 PAR化是可逆的，并且可以被PAR清除劑（例如聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG））解除（2，3）。

PARP1和PARP2感知單鏈DNA斷裂，鎖定在受損區(qū)域，然后將PAR鏈添加到其自身的骨架、組蛋白和其他修復(fù)蛋白中，以招募和激活這些蛋白質(zhì)。然后，由于帶負電荷的PAR鏈的變構(gòu)阻礙，PAR化的PARP1或PARP2從DNA分離，允許其他蛋白質(zhì)進入DNA并啟動修復(fù)過程。PARG的工作是去除PAR鏈，將修復(fù)蛋白回收到其非活性形式，這是各種DNA修復(fù)過程中的關(guān)鍵步驟（4）。

PARP 1/2抑制劑已成為成功的癌癥治療藥物，當(dāng)腫瘤細胞中同源重組修復(fù)（HRR）有缺陷時，可導(dǎo)致合成性致死（7）。事實上，目前美國有四種FDA批準(zhǔn)的藥物在臨床使用，還有更多的藥物正在研發(fā)中。

另一方面，PARG活性失調(diào)與各種疾病有關(guān)，包括癌癥（8）。靶向PARG治療作為一種使癌細胞對DNA損傷誘導(dǎo)劑敏感的策略正在獲得牽引力（9）。阻斷PARG活性導(dǎo)致PAR在蛋白質(zhì)上積聚，并干擾DNA修復(fù)機制，最終導(dǎo)致細胞死亡。因此，PARG抑制劑是一種有前途的治療途徑，特別是當(dāng)與DNA損傷誘導(dǎo)的放射或化學(xué)療法組合時。除了PARG，其他PAR清除劑也有助于PAR周轉(zhuǎn)和DNA修復(fù)，如MacroD1和MacroD2（含大結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)），TARG1（也稱為ARH3）和NUDT 16。

為什么測量細胞PAR化

基于細胞的分析是藥物開發(fā)過程的重要組成部分，因為它們使研究人員能夠評估候選藥物在活細胞中的生物活性，并更好地了解其作用機制。細胞測定對于評價化合物的膜滲透性問題和復(fù)雜系統(tǒng)內(nèi)的干擾是必要的，并且與生物化學(xué)測定相比，總體上提供了化合物和活細胞之間復(fù)雜相互作用的更準(zhǔn)確的表示。

因此，將藥物候選物如PARG或PARP抑制劑添加到感興趣的細胞中并測量所得的PAR化水平可以提供關(guān)于化合物在完整細胞中的有效性的寶貴信息。LysA?通用PAR化測定試劑盒評估細胞提取物中的PAR化，并允許測定化合物IC₅₀，比較各種化合物的IC₅₀，化合物在具有特定DDR缺陷的細胞中的作用等。

示例應(yīng)用

測量化療藥物誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激后的總PAR水平（例如，指示PARP是否被激活以及激活到何種程度）。
篩選或確定IC₅₀ PARP家族的抑制劑。
篩選或確定IC₅₀ PARG家族的抑制劑（PAR擦除劑）。
為PAR穩(wěn)態(tài)研究提供了一種新的細胞模型。
評價聯(lián)合治療可能產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)。
使用規(guī)定的PAR標(biāo)準(zhǔn)品定量生物樣品中的PAR水平。

測定原理

LysA?通用PAR化測定試劑盒是一種基于夾心ELISA的測定，旨在分析細胞提取物中存在的總PAR化水平。該試劑盒包括用于絕對定量的PAR標(biāo)準(zhǔn)品。該測定檢測例如由誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)或暴露于PARP抑制劑或PARG抑制劑引起的蛋白質(zhì)PAR化水平的差異。

原理：用對PAR化鏈特異性的抗PAR抗體包被96孔板。將來自細胞的裂解物加入包被的威爾斯孔中，并通過抗體捕獲細胞裂解物中存在的PAR化蛋白。隨后與抗PAR檢測抗體孵育，然后與HRP偶聯(lián)的二級抗體孵育。添加化學(xué)發(fā)光HRP底物提供了與細胞PARylation水平直接相關(guān)的發(fā)光信號。

該測定依賴于特異性抗PAR抗體，并且不檢測單ADP核糖基化（MARylation）。

通用PAR化測定試劑盒測定原理說明

圖2：測定原理說明

請記住，PAR水平反映了PAR寫入器和PAR擦除器之間的穩(wěn)態(tài)，預(yù)計添加特定抑制劑和/或使用DNA損傷劑將影響這種平衡。例如，添加PARG抑制劑通過阻斷PAR去除而將系統(tǒng)推向增加的PAR化，而添加PARP抑制劑降低蛋白質(zhì)PAR化。

PAR化穩(wěn)態(tài)

圖3：PAR化穩(wěn)態(tài)。DNA損傷激活PARP蛋白，導(dǎo)致形成PAR化DNA修復(fù)蛋白，包括PARP本身。一旦DNA修復(fù)啟動，PAR擦除器如PARG從蛋白質(zhì)中去除ADP-核糖單元，回收它們以再次響應(yīng)DNA損傷。任一反應(yīng)都可以被特異性抑制劑阻斷，導(dǎo)致PAR化蛋白質(zhì)的積累或非PAR化形式的突出，這取決于上下文。

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
RIPA裂解緩沖液 Modified RIPA Lysis Buffer (Moderate Strong)	82126	20 ml
ADP-核糖基化循環(huán)抑制劑混合物 ADP-Ribosylation Cycle Inhibitor Mix	82130	5 x 20 ?l
LysA?通用PAR化測定試劑盒 LysA? Universal PARylation Assay Kit	82123	96 reactions
PARP抑制劑 Set of PARP Inhibitors	78318	8 x 50 ?l

使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析的細胞實驗的實例

在誘導(dǎo)DNA損傷之前，用目標(biāo)化合物處理培養(yǎng)物中的細胞

圖4：在誘導(dǎo)DNA損傷之前，用目標(biāo)化合物處理培養(yǎng)物中的細胞。裂解細胞并使用LysA?通用PAR化測定試劑盒進行分析。

1)PARG抑制劑PDD00017273在各種細胞系中的滴定

將HEK 293、MCF 7、MDA-MB-231和HeLa細胞以0.5 × 10 - 6的細胞密度接種在96孔細胞培養(yǎng)板中。⁵ 細胞/孔，并在其相應(yīng)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到它們達到約70%匯合，對于HeLa和HEK 293細胞約24小時，對于MCF 7和MDA-MB-231細胞約48小時。
在不改變生長培養(yǎng)基的情況下，在加入過氧化氫（H）之前，將細胞在37 ℃下在沒有或有增加濃度的PARG抑制劑PDD 00017273（MedChem Express #HY-108360）的情況下處理1小時45分鐘。₂O₂，500 μM終濃度）再孵育15分鐘以誘導(dǎo)DNA損傷。請注意，PDD00017273貯備液最初在DMSO中制備，DMSO濃度（1%）在所有條件下（包括無抑制劑對照）保持恒定。
處理后，輕輕地從板上除去培養(yǎng)基，用冰冷的PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）洗滌細胞一次，置于冰上，用50 μl/孔的改良RIPA裂解緩沖液（BPS Bioscience #82126）補充蛋白酶抑制劑混合物和ADP-核糖基化循環(huán)抑制劑混合物（BPS Bioscience #82130).
在冰上10分鐘后，將裂解物上下吸移數(shù)次并收集。
立即使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析PAR化水平。在實驗前一天，將前一步驟中收集的每種裂解物的全部體積（50 μl/孔）加載到涂覆的白色96孔模塊Maxisorp?板中的相應(yīng)孔中。
在遵循LysA?通用PAR化測定試劑盒方案（BPS Bioscience#82123）之后，使用Bio-Tek酶標(biāo)儀測量發(fā)光。
結(jié)果表示為總PAR化的百分比（其中最大PAR化水平設(shè)定為100%）。

PARG抑制劑PDD00017273對不同細胞系中H2O2誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)PAR化的影響

圖5：PARG抑制劑PDD00017273對不同細胞系中H2O2誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)PAR化的影響.

如上所述，用遞增濃度的PARG抑制劑和H2O2處理細胞使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析細胞裂解物。結(jié)果表示為原始發(fā)光信號（左）或歸一化為總PAR化的百分比，其中每個細胞系的最大PAR化設(shè)定為100%（右）。對于每種細胞系，使用GraphPad Prism軟件計算IC₅₀并繪圖。數(shù)據(jù)表示來自單個實驗的生物學(xué)重復(fù)。

2)HEK293細胞中幾種PARP抑制劑的滴定

將HEK 293細胞以0.5 × 10 - 6的密度接種在96孔細胞培養(yǎng)板中⁵ 細胞/孔，并在它們的正常生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到它們達到約70%的匯合，約24小時。
在不改變生長培養(yǎng)基的情況下，將細胞用10 μM PARG抑制劑PDD 00017273（MedChem Express #HY-108360）與濃度增加的PARP抑制劑奧拉帕尼、他拉唑帕尼和AZD 5305（一組PARP抑制劑， BPS Bioscience #78318）在37°C下攪拌1小時45分鐘。過氧化氫（H₂O₂，500 μM終濃度）再添加15分鐘以誘導(dǎo)DNA損傷。請注意，抑制劑儲備液最初在DMSO中制備，在所有條件下（包括不含PARP抑制劑的對照品），DMSO和PARGi的濃度保持恒定（分別為1%和10 ?M）。
輕輕地從板上除去培養(yǎng)基，用冰冷的PBS洗滌細胞一次，置于冰上，用50 μl/孔的改良RIPA裂解緩沖液（BPS Bioscience #82126）補充蛋白酶抑制劑混合物和ADP-核糖基化循環(huán)抑制劑混合物（BPS Bioscience #82130).
在冰上10分鐘后，將裂解物上下吸移數(shù)次并收集。
立即使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析PAR化水平。將在前一步驟中收集的每種裂解物的全部體積（50 μl/孔）加載到實驗前一天包被的白色96孔模塊Maxisorp?板中的相應(yīng)孔中。
在遵循LysA?通用PAR化測定試劑盒方案（BPS Bioscience#82123）之后，使用Bio-Tek酶標(biāo)儀測量發(fā)光。
結(jié)果表示為總PAR化的百分比（其中在不存在抑制劑的情況下測量的PAR化水平設(shè)定為100%）。

PARP抑制劑對HEK 293細胞中H2O2

圖6：PARP抑制劑對HEK 293細胞中H2_O2

如上所述，在PARG抑制劑存在的情況下，用濃度增加的PARP抑制劑和H2_O2結(jié)果表示為原始發(fā)光信號（左），并標(biāo)準(zhǔn)化為總PARylation的百分比，其中最大PARylation設(shè)置為100%（右）。對于每種條件，使用GraphPad Prism軟件計算并繪制IC₅₀。數(shù)據(jù)表示來自單個實驗的生物學(xué)重復(fù)。