【介紹】

膠質(zhì)母細胞瘤是一種發(fā)生在大腦或脊髓的侵襲性癌癥。多年來，為了幫助理解膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)病機制和進展，人們開發(fā)了各種膠質(zhì)母細胞瘤模型。然而，由于促進這種疾病的遺傳和環(huán)境因素多種多樣且復(fù)雜，以及其起源組織的不確定性，這一過程變得復(fù)雜。 膠質(zhì)母細胞瘤的治療也很難開發(fā)，因為二維培養(yǎng)系統(tǒng)無法模擬腫瘤微環(huán)境。腫瘤的進展關(guān)鍵取決于腫瘤細胞與其微環(huán)境之間的相互作用。腫瘤微環(huán)境是異質(zhì)和動態(tài)的；它由細胞外基質(zhì)、基質(zhì)細胞、免疫細胞、祖細胞、血管和淋巴管組成，這在二維環(huán)境中是不可能重現(xiàn)的。各種研究表明，在二維環(huán)境中培養(yǎng)的腫瘤細胞在細胞增殖能力、抗凋亡能力、分化能力、侵襲能力甚至生物標志物表達方面表現(xiàn)出明顯的差異。此外，僅僅研究腫瘤來源的細胞是不夠的；腫瘤本質(zhì)上是三維的，這種形態(tài)在腫瘤進展中起著作用，即血管生成，這是惡性腫瘤的關(guān)鍵因素。此外，在膠質(zhì)母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)了具有類似干細胞特性的癌細胞，它們被認為是導(dǎo)致對常規(guī)治療的高抗性和高復(fù)發(fā)率的原因。因此，準確有效地開發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤的治療方法將需要三維模型，這些模型能夠緊密模擬三維腫瘤中表現(xiàn)出的細胞 - 細胞相互作用。 U - 87 MG細胞是一種人類原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤細胞系，常用于研究膠質(zhì)母細胞瘤的因果關(guān)系和進展。在這里，我們討論使用我們的二維和三維VitroGel可調(diào)支架培養(yǎng)這些細胞的生長情況。 材料和【方法】 

細胞培養(yǎng) 

U - 87 MG細胞在添加了10％FBS和1x pen - strep的Eagle最低必需培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)。當培養(yǎng)物達到80 - 90％匯合時進行傳代。對于2D水凝膠涂層培養(yǎng)和3D細胞培養(yǎng)，根據(jù)用戶手冊，使用VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS，如下所述。

2D涂層培養(yǎng)方法 

用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:0、1:1和1:3的稀釋度制備2D涂層水凝膠，然后與無細胞的U - 87 MG培養(yǎng)基以4:1的比例混合；向每個24孔板中加入300μL。水凝膠在室溫下穩(wěn)定20分鐘，然后將細胞添加到懸浮在300μL覆蓋培養(yǎng)基中的水凝膠頂部。每隔一天更換培養(yǎng)基。     

3D涂層培養(yǎng)方法 

根據(jù)制造商的方案，用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:1和1:3的稀釋度制備水凝膠。對于共聚焦/熒光成像，使用底部有蓋玻片的8孔室培養(yǎng)細胞，每孔使用200μL水凝膠。每隔一天更換培養(yǎng)基。 免疫

熒光（IF）成像 

對于IF成像，細胞在有蓋玻片的腔室載玻片上生長，而不是在8孔板上。每個腔室容納200μL水凝膠/細胞混合物。根據(jù)制造商的方案，使用Image - iT?固定/透化試劑盒、ActinGreen?488 ReadyProbes?試劑和NucBlue?固定細胞ReadyProbes?試劑（ThermoFisher）對細胞進行固定和染色。使用帶有ZEN軟件和ImageJ的Zeiss Axiovert 200M熒光細胞成像顯微鏡拍攝圖像。

【結(jié)果】 

在2D VitroGel系統(tǒng)上培養(yǎng)U - 87 MG細胞促進球體形態(tài)的形成。 為了研究我們的2D VitroGel系統(tǒng)是否有利于U - 87 MG細胞在二維系統(tǒng)中的生長，我們在我們的兩種VitroGel產(chǎn)品的各種稀釋液中培養(yǎng)它們。U - 87 MG細胞從人類膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤中收獲，盡管在標準的2D培養(yǎng)中它們的固有性質(zhì)是聚集，但它們采用成纖維細胞樣形態(tài)，僅形成小聚集體（圖1A）。在VitroGel水凝膠中，細胞表現(xiàn)出更多的球體聚集，即使在較低的稀釋度下（圖1B - E）。在兩種水凝膠的1:3稀釋度下（圖1C，E），形成的集落較小，但在新的更軟的VitroGel RGD - PLUS中，細胞聚集體表現(xiàn)出一種有趣的形態(tài)特征：它們在聚集體之間形成橋梁（圖1E）。

 圖1：U - 87 MG細胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS的2D水凝膠厚涂層表面上生長2天。在1:0稀釋度下，細胞在兩種水凝膠的表面聚集形成球體（B，C）。在1:3稀釋度下（C，E），柔軟的物質(zhì)有助于細胞在VitroGel RGD - PLUS表面的不同球體之間建立連接（黃色箭頭）。 VitroGel RGD - PLUS在3D培養(yǎng)7天后促進細胞間網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展 為了進一步研究VitroGel RGD - PLUS促進細胞間網(wǎng)絡(luò)形成的能力，我們在不同稀釋度的三維培養(yǎng)中培養(yǎng)U - 87 MG細胞。我們發(fā)現(xiàn)，在原始VitroGel 3D - RGD的兩種濃度下，細胞都可以在水凝膠中沉淀和生長（第2天，圖2A - B），但在7天后（圖2D - E），它們的總體擴散沒有改變，它們可以形成簇狀結(jié)構(gòu)，但沒有表現(xiàn)出細胞間網(wǎng)絡(luò)連接（圖2E）。在VitroGel RGD - PLUS中，細胞不僅在第2天就沉淀到水凝膠中，而且它們表現(xiàn)出與VitroGel 3D - RGD中細胞明顯不同的形態(tài)：它們更長，并開始建立細胞間網(wǎng)絡(luò)。7天后，它們在3D水凝膠中表現(xiàn)出廣泛的細胞 - 細胞連接（圖2H - I），其簇比VitroGel 3D - RGD中的簇大得多（圖2J）。

圖2：U - 87 MG細胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS中培養(yǎng)。細胞可以在兩種水凝膠的1:1和1:3稀釋度的3D水凝膠中生長。細胞在VitroGel 3D - RGD中融入水凝膠（A - D），但無法形成網(wǎng)絡(luò)連接（E）。然而，在新的VitroGel RGD - PLUS中，細胞在2天后融入（F - G），但在第7天能夠形成細胞間肌動蛋白連接（H - J）。

【討論】 

與VitroGel 3D - RGD中的球體結(jié)構(gòu)不同，U - 87 MG細胞在VitroGel RGD - PLUS中創(chuàng)建更好的細胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明更好的細胞 - 細胞和細胞 - 基質(zhì)相互作用。這些相互作用是正確重現(xiàn)體內(nèi)組織組織和再生以及體外癌癥的關(guān)鍵部分。盡管這一點得到了認可，但研究人員發(fā)現(xiàn)很難解決這個問題，因為這個問題不僅僅有一種解決方案。例如，在標準的體內(nèi)細胞生態(tài)位中，存在各種類型的細胞相互作用、形狀、連接等。對現(xiàn)有三維支架的研究表明，驅(qū)動組織表面張力從而影響細胞命運的細胞間凝聚力在組織的不同部分之間可能會有很大差異。考慮到一些三維基質(zhì)更適合某些細胞類型而不適合其他細胞類型，這會給試圖使用三維細胞培養(yǎng)方法的研究帶來一定程度的變異性，這可能會成為問題。即使在我們自己的研究中，這一點也很明顯。我們看到，相同基質(zhì)的不同濃度可能導(dǎo)致不同的細胞行為，即使細胞能夠在所有濃度下生長。 產(chǎn)生適當?shù)募毎饣|(zhì)相互作用的能力也將是正確理解腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵部分。大量的癌癥進展是由于腫瘤細胞與周圍環(huán)境相互作用的能力。例如，在腫瘤生長期間，轉(zhuǎn)移過程始于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的剝奪，這會觸發(fā)血管生成生長因子和細胞因子的釋放，從而導(dǎo)致血管生成。這種營養(yǎng)和氧氣剝奪只有在達到一定的生長閾值后才會發(fā)生，而這在二維培養(yǎng)中是無法實現(xiàn)的，并且需要適當?shù)募毎?nbsp;- 細胞和細胞 - 基質(zhì)相互作用才能實現(xiàn)體內(nèi)建模。 我們的研究和其他研究表明，一個更可調(diào)的系統(tǒng)最終可能最有希望在體外真正模擬體內(nèi)系統(tǒng)。器官再生的未來將需要開發(fā)能夠捕捉體內(nèi)細胞外基質(zhì)特性復(fù)雜性的平臺，同時也能夠調(diào)整基質(zhì)特性，為組織內(nèi)的各種細胞提供體內(nèi)環(huán)境。未來的癌癥研究將依賴于一個三維可調(diào)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將真實地代表實體瘤的生長，并將真實地重現(xiàn)腫瘤對假定治療的反應(yīng)。以前對VitroGel可調(diào)水凝膠的研究表明，它們是藥物測試的可行選擇，各種研究已經(jīng)證明了這種水凝膠在癌癥研究中的成功。新的VitroGel RGD - PLUS中細胞網(wǎng)絡(luò)能力的增強表明，這種新的基質(zhì)可能為癌癥和再生醫(yī)學研究提供可行的解決方案。

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