人類 I 型干擾素包括多個(gè)成員，如 IFN-α (干擾素α)、IFN-β (干擾素β)、IFN-κ (干擾素κ)、IFN-ε (干擾素ε) 和 IFN-ω (干擾素ω) 鏈?。IFN-β 是一種由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和防御細(xì)菌、病毒和腫瘤等病原體方面起著至關(guān)重要的作用?。IFN-β 對(duì) I 型干擾素受體 (IFNAR) 具有高親和力，該受體由 IFN-α 受體 1 (IFNAR1) 和 IFN-α 受體 2 (IFNAR2) 鏈組成?。重組 IFN-β 仍然是治療多發(fā)性硬化癥 (MS) 患者的關(guān)鍵療法。多發(fā)性硬化癥是一種影響中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 的自身免疫性疾病，該療法可降低復(fù)發(fā)頻率?。準(zhǔn)確和精確定量 IFN-β 對(duì)于進(jìn)一步了解其在適應(yīng)性免疫中的作用以及開發(fā)針對(duì)自身免疫性疾病和其他疾病的新療法具有重要意義。

以干擾素過度產(chǎn)生為特征的疾病

pbl的VeriKine高靈敏度人干擾素β血清ELISA（貨號(hào)41415）能夠準(zhǔn)確定量復(fù)雜生物樣本（包括自身免疫血清、正常血清/血漿和組織培養(yǎng)基 (TCM)）中低至 pg/ml 水平的人 IFN-β。該 ELISA 的檢測(cè)范圍為 1.2-150 pg/ml，定量下限 (LLOQ) 為 1.2 pg/ml。IFN-β 與包被在板上的捕獲抗體結(jié)合，并通過生物素化的二抗進(jìn)行檢測(cè)，隨后使用與辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯(lián)的鏈霉親和素。四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 用作底物。

進(jìn)行了多項(xiàng)研究以評(píng)估該試劑盒的穩(wěn)健性、靈敏度和準(zhǔn)確性。

使用方案 A 測(cè)量了正常人血清 (NHS)、多發(fā)性硬化癥 (MS) 患者血清和人血漿中的 IFN-β 濃度，該方案旨在提高血清樣本中的性能。NHS、MS 患者血清和使用不同抗凝劑（乙二胺四乙酸二鈉、肝素鈉、檸檬酸鈉）的血漿采集自 Bioreclamation (BioIVT) 和科德角臨床研究中心。試劑盒內(nèi)提供了哺乳動(dòng)物來源的人 IFN-β 標(biāo)準(zhǔn)品。所有標(biāo)準(zhǔn)品和加標(biāo)樣本均由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的 IFN-β1a 組成。

結(jié)果

圖 1. 不同基質(zhì)中的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在正常人血清 (NHS)、組織培養(yǎng)基 (TCM) 和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 (SD) 中制備了人 IFN-β ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。上圖顯示了在多個(gè)板子上進(jìn)行的 8 次標(biāo)準(zhǔn)稀釋液和 NHS 中運(yùn)行的平均值，以及 4 次 TCM 中運(yùn)行的平均值。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖 2. 正常人血清 (NHS) 中的加標(biāo)回收率。 上圖描繪了使用一個(gè)低背景批次的 NHS 在多個(gè)板子上進(jìn)行的 8 次運(yùn)行的平均值。測(cè)試了三個(gè)目標(biāo) IFN-β 加標(biāo)水平：高 (100 pg/ml)、中 (20 pg/ml) 和低 (4 pg/ml)。加標(biāo)濃度根據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。IFN-β 的測(cè)量準(zhǔn)確度在預(yù)期值的 +/- 20% 以內(nèi)。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。

圖 5. 批次間一致性。 評(píng)估了 8 個(gè)不同批次的 41415 人 IFN-β 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，并與最近一批 41415 (L-6966) 進(jìn)行了比較。過期試劑盒批次（以斜體和星號(hào) (\*) 表示）作為持續(xù)穩(wěn)定性研究的一部分進(jìn)行了測(cè)試。L-6790 和 L-6672 在過期后一年內(nèi)測(cè)試，L-6428 和 L-6530 在過期后一年測(cè)試，L-6277 在過期后兩年測(cè)試。IFN-β 的檢測(cè)準(zhǔn)確度在計(jì)算平均濃度的 +/- 20% 以內(nèi)。誤差線表示兩次運(yùn)行之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。除 150 和 1.17 pg/ml 濃度外，所有濃度均運(yùn)行兩次。

圖 6. 正常人血清 (NHS) 中的稀釋線性。 使用一個(gè)低背景人血清批次制備了 5 份獨(dú)立的 80 pg/ml 加標(biāo)樣本。在標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中對(duì)加標(biāo)樣本進(jìn)行了五次兩倍系列稀釋。加標(biāo)樣本在 3 個(gè)不同的日期進(jìn)行了測(cè)試。不同稀釋度加標(biāo)樣本的濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。IFN-β 的檢測(cè)準(zhǔn)確度在預(yù)期值的 +/- 20% 以內(nèi)，但一次運(yùn)行中的單個(gè)稀釋度除外。

圖 7. 多發(fā)性硬化癥 (MS) 樣本中的稀釋線性。 在 4 個(gè)不同的 IFN-β 陽(yáng)性血清樣本（來自接受 IFN-β 治療的個(gè)體 MS 患者）中測(cè)試了檢測(cè)的線性。所有樣本先前均經(jīng)過 IFN-β 檢測(cè)。除樣本 6276 (±) 運(yùn)行了兩次外，所有樣本均在單次實(shí)驗(yàn)中運(yùn)行。每個(gè)血清樣本在標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中進(jìn)行了五次或六次兩倍系列稀釋。IFN-β 的濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。IFN-β 的檢測(cè)準(zhǔn)確度在標(biāo)稱值的 +/- 20% 以內(nèi)。稀釋的標(biāo)稱濃度基于原液樣本中測(cè)得的值。

圖 8. 正常人血清 (NHS) 和多發(fā)性硬化癥 (MS) 患者血清中定量到的 IFN-β 水平。 檢測(cè)了 43 份 MS 血清樣本和 15 份 NHS 樣本中的 IFN-β。23 名 MS 患者接受 IFN-β 治療，20 名接受其他療法。在接受 IFN-β 治療的 23 名 MS 患者中，2 名使用 Betaseron (Beta 1b)，其余 21 名使用 Rebif 和 Avonex (Beta 1a)。在接受 IFN-β 治療的 MS 患者中，87% 的患者可定量檢測(cè)到 IFN-β，而在接受其他療法的患者中，這一比例為 5%。所有低于 LLOQ 的樣本在圖中均以 1.0 pg/ml 的水平標(biāo)繪。

總結(jié)

PBL 的VeriKine高靈敏度人干擾素β血清ELISA（貨號(hào)41415）在自身免疫血清、正常血清、組織培養(yǎng)基（補(bǔ)充有 10% FBS 的 DMEM）以及含有抗凝劑乙二胺四乙酸二鈉、肝素鈉或檸檬酸鈉的血漿中表現(xiàn)良好。該 ELISA 可準(zhǔn)確定量自身免疫血清中低至約 1.2 pg/ml 的 IFN-β 1a。在生物分析研究中，可以評(píng)估這些基質(zhì)中未知濃度的 IFN-β（在檢測(cè)范圍內(nèi)）。

對(duì)舊批次和近期批次試劑盒的重復(fù)測(cè)試揭示了該 ELISA 的穩(wěn)健性、靈敏度以及批次間的一致性。

可溶性 IFNAR2 (sIFNAR2) 不影響 IFN-β 的檢測(cè)。41415 ELISA 似乎能夠檢測(cè)血清中與 sIFNAR2 結(jié)合的 IFN-β 以及游離的 IFN-β。

一項(xiàng)持續(xù)進(jìn)行的穩(wěn)定性研究表明，人 IFN-β 標(biāo)準(zhǔn)品隨時(shí)間保持穩(wěn)定，可用于多個(gè)批次中準(zhǔn)確測(cè)量 IFN-β。

人 IFN-β ELISA 在正常人血清 (NHS) 和自身免疫血清（如來自 MS 患者的血清）中均表現(xiàn)出良好的稀釋線性性能。該檢測(cè)在復(fù)雜基質(zhì)中的多個(gè)稀釋水平上提供精確的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

1. Piehler, J., Thomas, C., Garcia, K. C., & Schreiber, G. (2012). Structural and dynamic determinants of type I interferon receptor assembly and their functional interpretation. Immunological reviews, 250(1), 317-34.

2. Hunt, M. & Hunt, R. (2018). Interferon. [online] Available at: http://www.microbiologybook.org/mhunt/interferon.htm.

3. Kasper, L. and Reder, A. (2014). Immunomodulatory activity of interferon-beta. Annals of Clinical and Translational Neurology, 1(8), pp.622-631.