幾十年來(lái)，已經(jīng)建立了許多體外刺激T細(xì)胞的方法，從不太特異的PHA促生物素，到更具針對(duì)性的抗CD3單克隆抗體，再到抗體包被的磁珠。其中大多數(shù)利用了T細(xì)胞生物學(xué)的優(yōu)勢(shì)，主要針對(duì)T細(xì)胞受體（TCR）的結(jié)合，啟動(dòng)足夠的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，推動(dòng)有效的激活、增殖和分化。反過(guò)來(lái)，激活T細(xì)胞在基礎(chǔ)研究和臨床環(huán)境中具有多種用途。對(duì)激活T細(xì)胞的研究有助于詳細(xì)了解生物學(xué)現(xiàn)象，如免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、胸腺細(xì)胞發(fā)育和T細(xì)胞記憶形成，以及T細(xì)胞功能障礙或衰竭。刺激不僅允許免疫細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)，包括選擇和擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞克隆，還可以提高基因修飾方法的效率。因此，T細(xì)胞激活也是基因工程T細(xì)胞制造過(guò)程中的一步，可實(shí)現(xiàn)高效的編輯和非克隆性擴(kuò)增至臨床意義的劑量，選擇適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞刺激試劑以誘導(dǎo)足夠的T細(xì)胞反應(yīng)非常重要。 

現(xiàn)今典型的T細(xì)胞的刺激方法是基于至少雙價(jià)抗CD3和抗CD28抗體的刺激。多價(jià)結(jié)合是必要的，因?yàn)閮H結(jié)合TCR（定義為信號(hào)1）不會(huì)引起完全的T細(xì)胞激活，而是導(dǎo)致非響應(yīng)狀態(tài)。因此，除了TCR外，共刺激受體，尤其是CD28，必須提供支持性信號(hào)（稱(chēng)為信號(hào)2）。CD28介導(dǎo)的共刺激與TCR信號(hào)協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞存活、克隆擴(kuò)增和分化。  

Biogradetech人的T激活劑CD3/CD28由與人CD3和CD28抗體包被的4.5um磁珠組成，為人的T細(xì)胞的分離和擴(kuò)增提供了簡(jiǎn)單有效的方法。首先，該激活劑能夠輕松地從外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中分離和濃縮CD3+ T細(xì)胞。在分離后，磁珠上的抗CD3和抗CD28抗體的共價(jià)結(jié)合提供了調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活和擴(kuò)增所需的初級(jí)和共刺激信號(hào)。在細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)需要額外添加其他細(xì)胞因子，如人IL-2、IL-7和IL-15，以更高效地激活細(xì)胞。經(jīng)過(guò)10-13天的培養(yǎng)期，激活的細(xì)胞可以擴(kuò)增1000倍。

實(shí)驗(yàn)步驟（簡(jiǎn)易漢化，請(qǐng)務(wù)必以英文原版說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)）：

1. 清洗T激活劑CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠：

1.1將人T激活劑CD3/CD28磁珠懸浮于管中（渦旋離心30秒以上，或傾斜和旋轉(zhuǎn)5分鐘）。 

1.2將珠子轉(zhuǎn)移到容器中。

1.3 加入等體積的PBS（含1% HSA）。如果珠子體積小于1mL，添加1mL含有1% HSA的PBS進(jìn)行懸浮。 

1.4將管子放在磁鐵上1分鐘，然后棄掉上清液。 1.5將管子從磁鐵上取下，然后用相同體積的PBS（含1% HSA）重新懸浮珠子。  

2. 分離CD3+ T細(xì)胞：

2.1對(duì)于Ficoll分離的PBMCs，輕輕將細(xì)胞懸浮在PBS（含1% HSA）中，并將細(xì)胞密度調(diào)整為2-5×107個(gè)細(xì)胞/毫升。注意，細(xì)胞的總數(shù)不應(yīng)超過(guò)2×108個(gè)細(xì)胞/毫升。 

注意：在開(kāi)始之前，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定樣品中CD3+ T細(xì)胞的百分比。 

2.2將洗滌的珠子與PBMCs以3（珠子）：1（CD3+ T細(xì)胞）的比例加入，如果細(xì)胞是純分離的T細(xì)胞，則將珠子與細(xì)胞的比例調(diào)整為1：1。 

2.3以50~120轉(zhuǎn)/分鐘的速度旋轉(zhuǎn)樣品，并在室溫下孵育30分鐘。 

2.4用T細(xì)胞培養(yǎng)基或含有1% HSA的PBS稀釋珠子和細(xì)胞的混合物，以確保磁選的分離體積。然后將管子放在磁鐵上1~2分鐘。 

2.5移除上清液，然后用含有300 IU/mL IL-2的T細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮珠子和細(xì)胞的混合物，并將細(xì)胞密度調(diào)整為0.5×10^6個(gè)細(xì)胞/毫升~1×10^6個(gè)細(xì)胞/毫升。 2.6將細(xì)胞懸浮液放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。  

3. T細(xì)胞的激活和擴(kuò)增：

3.1每天從培養(yǎng)的第3天開(kāi)始計(jì)算T細(xì)胞的數(shù)量。 

3.2在細(xì)胞擴(kuò)增的后期，定期輕輕吹動(dòng)培養(yǎng)中的細(xì)胞懸浮液，以分離珠子和細(xì)胞。 

3.3當(dāng)CD3+ T細(xì)胞數(shù)目>1×10^6個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)，加入含有IL-2的T細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)整到約0.5×10^5個(gè)細(xì)胞/毫升。 

3.4在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（第9-14天），計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，并用磁鐵去除珠子。  

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離CD3細(xì)胞：PBMC與CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠（貨號(hào)C-BETA2001）按照3：1的比例孵育30分鐘，然后用流式細(xì)胞術(shù)分析陽(yáng)性(分離)部分的分離效率。

激活純化的CD3+ T細(xì)胞：用CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠（貨號(hào)C-BETA2001）激活純化的人CD3+ T細(xì)胞， 孵育48小時(shí)后，用APC標(biāo)記的抗人CD25抗體和PE標(biāo)記的抗人CD69抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。

純化的CD3+T細(xì)胞擴(kuò)增。用CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠（貨號(hào)C-BETA2001）刺激純化的人CD3+T細(xì)胞。細(xì)胞在含有3001U/mL IL-2的T細(xì)胞培養(yǎng)基中擴(kuò)增。活化后的細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)間可達(dá)13天(左)，細(xì)胞存活率較高(右)。   

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