小鼠膠原蛋白誘發(fā)性關節(jié)炎(Collagen induced arthritis, CIA)與人類類風濕關節(jié)炎具有共同的免疫學和病理學特征。因此CIA模型被廣泛應用于研究致病機理和治療方案的研究。盡管該模型具有高度可重復性，但要成功誘導高發(fā)病率和嚴重程度的關節(jié)炎，一些影響造模的因素需要考慮。

1. 影響造模的因素

a. 動物來源:即使來自不同供應商的同樣品系的小鼠也可能會造成實驗結果的差異，建議開展實驗前先測試不同供應商提供的小鼠。

b. 飼養(yǎng)條件和飲食：為避免細菌和病毒感染在實驗中引起的差異，建議在無特定病原體(SPF級)條件下飼養(yǎng)動物。一般來說，對于腸道菌群，不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應答。例如，對于感染肝炎病毒（MHV）的小鼠，膠原蛋白不能誘發(fā)關節(jié)炎。飲食也會影響關節(jié)炎的發(fā)病率和嚴重程度，CIA在飼喂不同飼料的小鼠中差異很大。飼喂高脂肪的食物更容易引起高發(fā)病率關節(jié)炎。

c. 小鼠年齡和品系：建議使用具有成熟免疫系統(tǒng)的7-8周齡的小鼠。老齡小鼠可能對CIA的易感性較差。建議在重復實驗中使用相同周齡的小鼠。小鼠對CIA的易感性與 MHC-II 類分子相關， 同時也取決于接種二型膠原蛋白的小鼠品系。DBA/1(H-2^q)和B10.RIII(H-2^r)品系的小鼠被廣泛應用，因為這兩個品系對CIA高度易感。DBA/1(H-2^q )小鼠，對雞，牛和豬的二型膠原有免疫應答。B10.RIII小鼠對牛和豬二型膠原有免疫應答，但對雞二型膠原的免疫應答較弱。DBA/1(H-2^q)和B10.RIII(H-2^r)兩種品系小鼠對小鼠的二型膠原蛋白免疫應答較弱，關節(jié)炎發(fā)生率低于10%。另一方面，CIA抗性的小鼠也可能產生關節(jié)炎抗體。 表明小鼠對CIA的敏感性不僅取決于MHC類型。研究表明，CIA抗性的小鼠C57BL/6,129/Sv(H-2^b)和Balb/c(H-2^d)，當INF-g和IL-10基因敲除后，小鼠能產生關節(jié)炎自身抗體從而發(fā)生關節(jié)炎。這表明，對關節(jié)炎的敏感性也取決于不同細胞因子水平。下表為用于CIA及抗膠原蛋白抗體誘導（CAIA）的關節(jié)炎動物模型研究的常用小鼠品系。

備注： *需要含高劑量結核桿菌的完全弗式佐劑誘導關節(jié)炎，（）—假設，沒有測試

d. 佐劑：含有結核桿菌的完全弗式佐劑對于誘發(fā)小鼠關節(jié)炎很重要。不同于大鼠，二型膠原加不完全弗式佐劑（不含結核桿菌）無法誘導小鼠關節(jié)炎。強烈的抗體反應以及正確的抗體亞型對于誘導小鼠關節(jié)炎至關重要。抗體的產生取決于完全弗式佐劑中結核分枝桿菌的濃度，足夠的抗膠原IgG2a和IgG2b亞型抗體水平是激活補體所必需的，這是誘導關節(jié)炎的必要步驟。最近， Campbell等人用完全弗式佐劑（5mg/ml）在對CIA 抗性的小鼠中成功誘發(fā)高發(fā)病率的關節(jié)炎（50-70%），例如：C57BL/6, B10, and 129/Sv mice (H-2b)（10）。然而含高濃度結核桿菌的完全弗式佐劑會誘發(fā)嚴重的炎癥， 所以佐劑濃度（結核桿菌含量）取決于各研究單位動物管理委員會要求。

e. 膠原蛋白：因為去糖基化的膠原會影響關節(jié)炎的產生，同時一些未去除的雜質（比如：胃蛋白酶）可能會導致T細胞刺激試驗中產生假陽性，因此二型膠原應按規(guī)定高度純化。凍干的膠原在-20℃避光保存的條件下是非常穩(wěn)定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸(Cat#9075)中，終濃度為 2-4mg/ml，溫和攪拌，4℃過夜。膠原溶液可在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 提供較完整的不同免疫級別二型膠原。備注：DBA/1小鼠對雞或者牛的二型膠原蛋白有較強的免疫反應，C57B/6小鼠只對雞的二型膠原蛋白有免疫反應。

2. 膠原蛋白誘導小鼠關節(jié)炎實驗方案

a. 乳劑制備:乳劑的質量對于誘發(fā)關節(jié)炎至關重要。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦雙注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導致乳劑不能夠有效的、穩(wěn)定的誘發(fā)關節(jié)炎。此外，超聲處理方法將膠原至少分成2個片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。推薦使用電動的高速攪拌器：

(1) 用高速攪拌器 (圖1)（帶直徑≤5mm 的刀片，圖2a）攪拌完全佐劑CFA (或用于增強劑注射的不完全佐劑（IFA）)和膠原溶液。將注射器尖端用三通閥封閉 (圖2b)。把注射器夾緊，固定在鐵架臺上， 并冰浴 (圖3)。最后一步很重要，因在攪拌過程中會發(fā)熱，會引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發(fā)關節(jié)炎（CIA）。

圖1. 高速攪拌器	圖2. (a) 攪拌器刀片-直徑0.5cm(b)帶三通閥的注射器（c）玻璃注射器	圖3. 帶三通閥的注射器固定在支架上，冰浴

（2）加1體積（最多不超過注射器的25%）完全弗式佐劑（不完全弗式佐劑在加強免疫時用到）到注射器，再緩慢加入等體積的膠原溶液（0.05M 醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度為 2mg/ml），邊低速攪拌（1000-3000rpm）邊滴入膠原溶液。注意：為保證高質量的免疫乳劑，一次量乳劑體積應不得超過注射器體積的50%。如果需要多量生產，可重復以上步驟。

（3）繼續(xù)高速混合（10,000–30,000rpm）2分鐘。冷卻5分鐘，再重復高速混合和冷卻步驟2-3次直到產生穩(wěn)定的乳液。對于較大的體積（2-5ml），為了使乳液混合均勻，建議在混勻過程中上下移動攪拌刀片。

（4）用針頭替換三通閥，在裝有冰水的燒杯里滴一滴乳劑，檢測乳劑的穩(wěn)定性。如果乳劑是穩(wěn)定的， 如圖所示（圖4），在水中是成團的，不散開。如果乳劑在水中散開，表明乳劑不穩(wěn)定，再加幾滴佐劑，重新混合再次進行測試。

圖4.完整穩(wěn)定的乳劑漂浮在水面

（5）將乳劑轉移到1ml的玻璃注射器 （圖2C），不建議采用塑料注射器，因為很難做到一個準確的注射劑量。備注：通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個精確的注射劑量；建議在乳劑制備好的1小時內完成注射。乳劑在使用之前存放在4℃。

b. 免疫注射部位:在鼠尾根部皮下注射0.1ml乳劑(100ug膠原每只老鼠 （圖5）。例如：從尾根部2cm處插入針頭（25號或者27號針頭，長度5/8英尺，針插入皮下，針頭沿斜向 上與鼠尾方向平行插入，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。每次注射前充分擦拭針頭，防止乳液的露出。如果要加強免疫，注射部位在尾根部 3cm 處，針尖插入皮下距鼠尾根部1.5cm處。加強免疫的注射部位應避開初始注射部位）。備注: Chondrex不建議使用背部皮下注射注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，因為乳劑會引起腹腔和胸腔嚴重的炎癥反應。

圖5. 皮下注射乳劑

c. 免疫程序: 根據(jù)小鼠品系和實驗目的的不同，誘導高發(fā)病率和嚴重關節(jié)炎的方法也各有不同。

(1) 通過單次免疫（無需加強免疫）誘發(fā)關節(jié)炎（易感品系）:注射膠原和完全弗式佐劑混合而成的含2mg/ml結合桿菌乳劑。對于易感品系小鼠DBA/1（H-2^q）和 B10.RIII(H-2^r )注射乳劑后28-35天會引發(fā)關節(jié)炎。42- 56天發(fā)病率達90-100%。關節(jié)炎嚴重程度高，臨床評分達10-12分（最高16分）。備注：由于高濃度的結核桿菌會引起免疫部位嚴重的炎癥反應，因此根據(jù)各研究機構對動物實驗的要求，可選用方案（2）或方案（4）。

(2) 通過加強免疫誘發(fā)關節(jié)炎（易感品系）：注射膠原和完全弗式佐劑混合而成的含0.5mg/ml結合桿菌乳。在初次注射后第21天，加強注射膠原和不完全弗式佐劑（不含結核桿菌）混合而成的乳劑。尾部皮下注射0.1ml乳劑，避開初次免疫部位。一般在初次免疫注射后28-35天引發(fā)關節(jié)炎。在第42-56天，發(fā)病率為80-100%，臨床評分可達8-12分（最高16分）。

(3) 用高劑量的結核桿菌完全佐劑加強免疫誘發(fā)關節(jié)炎（CIA抗性小鼠）：對于一些低反應的小鼠，例如：B10 (H-2^b ), C57BL/6 (H-2^b ), and C57BL/6x129/Sv (H-2^b) ，采用以下方案可誘發(fā)關節(jié)炎。初次免疫，尾部皮下注射0.1ml膠原和完 全佐劑混合而成的含2.5mg/ml結核桿菌的乳劑。在第21天加強免疫，再次注射0.1ml膠原和完全佐劑混合而成的含2.5mg/ml結核桿菌的乳劑。一般在初次免疫注射后28-35天引發(fā)關節(jié)炎。在第42-56天，發(fā)病率為50-70%。備注：該方案引起的炎癥反應比較嚴重，根據(jù)各研究機構對動物實驗的要求，可選用膠原抗體（CAIA） 誘發(fā)的小鼠關節(jié)炎模型。Chondrex公司的單克隆抗體合劑（Arthrogen-CIA）和LPS能在CIA抗性的小鼠中誘發(fā)關節(jié)炎。

(4) 通過LPS加強免疫：LPS和體內二型膠原自身抗體水平對于誘發(fā)關節(jié)炎具有協(xié)同效應(13)。此外，在經典的CIA動物模型中，應用LPS(B細胞分裂素)或關節(jié)炎支原體(支原體產生的T細胞分裂素)(MAM)或葡萄球菌B型腸毒素(金黃色葡萄球菌產生的T 細胞分裂素)(SEB)都會加強關節(jié)炎發(fā)病率和嚴重程度。因此這些毒素不僅用于引發(fā)和加強關節(jié)炎水平，而且用于指定關節(jié)炎發(fā)生時間。這個方案，需要注射0.1ml二型膠原和含0.5mg/ml的CFA混合乳劑（參考方案(2)）。在第25-28天或在關節(jié)炎發(fā)生前3-5天腹腔注射LPS(25-50ug，溶解在生理鹽水)。關節(jié)炎將在24-48小時發(fā)生，發(fā)病率90-100%。備注：CFA免疫注射小鼠會在2-4周發(fā)生嚴重的免疫抑制。所以一些小鼠對LPS（50ug）注射非常敏感。 Chondrex建議進行正式實驗之前先對來自不同供應商的動物進行測試。

d.關節(jié)炎的發(fā)作:有效的免疫注射后，臨床上明顯的關節(jié)腫脹癥狀會在3-5周出現(xiàn)。關節(jié)炎的發(fā)作和發(fā)病率取決于小鼠品系和實驗方案。