【介紹】

與傳統(tǒng)的二維（2D）培養(yǎng)相比，三維（3D）組織培養(yǎng)具有眾多優(yōu)勢^{[1; 5]}。最大限度地減少對硬表面的接觸可以改善細胞的成熟和存活，并提供一個更類似于細胞在體內所接觸的環(huán)境。結合將特定的小分子引入3D水凝膠配方，并整合細胞附著位點如RGD肽，最近已經能夠在體外更全面地重現(xiàn)越來越多的器官生態(tài)位，這有利于藥物發(fā)現(xiàn)和功能性組織工程^[2]。雖然來自小鼠細胞外基質（ECM）的水凝膠選項如Matrigel?和Geltrex?已經成為3D組織領域的主力一段時間了，但重要的是要注意，它們是從癌細胞培養(yǎng)物中分離出來的，不是化學定義的，也不是無動物源的；這對于再生醫(yī)學和人類3D組織建模的轉化工作都是主要挑戰(zhàn)^[3]。

在淺水凝膠涂層板表面上接種細胞是全3D培養(yǎng)和傳統(tǒng)2D培養(yǎng)之間的一種有吸引力的折衷方案，因為它允許細胞避免接觸硬表面，并可以促進細胞存活和成熟，同時仍然能夠保持高度的可重復性和可擴展性。這些優(yōu)勢對神經培養(yǎng)特別有益，因為這些細胞平均來說更脆弱，需要一個通常更復雜的組織生態(tài)位，并且對調節(jié)要求更嚴格，以重現(xiàn)適當?shù)纳窠浌δ芎统墒?/span>^[4]。在這里，我們比較了在常見的成熟測定中，在厚水凝膠涂層（淺3D組織培養(yǎng)）上生長的廣泛使用的永生化神經元細胞類型的形態(tài)、自我組織和存活情況。

【材料和方法】

神經細胞在未分化狀態(tài)下的維持

B35大鼠神經母細胞瘤永生化細胞（ATCC CRL - 2754）用于在體外模擬神經元的長期成熟和存活。細胞在補充有10％FBS和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中保持活躍分裂和未分化狀態(tài)，如有必要，每周進行兩次完全培養(yǎng)基更換。當培養(yǎng)物達到約80％匯合時，使用胰蛋白酶 - EDTA在室溫下孵育5分鐘，以1:10的比例傳代。平均而言，以這種方式維持的培養(yǎng)物可以每4天傳代一次，并可以擴增超過20代，而不會失去分裂潛力，或在血清撤出后其成熟狀態(tài)不會退化。

神經元在VitroGel和Matrigel上的分化和生長，用于2D厚凝膠涂層（淺3D培養(yǎng)）

B35神經元通過根據(jù)ATCC指南撤出血清在2D厚水凝膠涂層（淺3D封裝）培養(yǎng)中進行分化。簡而言之，為了達到功能性神經狀態(tài)，B35細胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中維持，在約5天內它們變得后有絲分裂和突觸活性。

對于2D厚水凝膠涂層（淺3D培養(yǎng)），未分化的B35細胞添加在VitroGel 3D（TWG001；TheWell Bioscience。水凝膠與DMEM的比例為4:1）或Matrigel（80％Matrigel，20％在DMEM中）的頂部。兩種水凝膠均在37°C下凝膠20分鐘，然后用B35分化培養(yǎng)基（DMEM +青霉素/鏈霉素）灌注長達21天。

淺3D組織培養(yǎng)在體外21天孵育期間的表征

在將細胞接種到水凝膠上后立即撤出培養(yǎng)中的FBS以誘導分化。隨后，細胞每周喂食兩次，每次進行完全無血清培養(yǎng)基更換，持續(xù)三周。

神經培養(yǎng)的免疫細胞化學分析

為了表征培養(yǎng)狀態(tài)、形態(tài)和存活情況，細胞在第3天、第7天、第9天和第21天固定，并對神經元特異性標記物Beta - III - Tubulin（T5076；Sigma - Aldrich）進行染色，以觀察細胞對表面的附著、形態(tài)和細胞數(shù)量。細胞用驢抗小鼠AlexaFluor647（ThermoFisher）和DAPI（ThermoFisher）核染色劑進行復染。

【結果】

長期分化的神經培養(yǎng)物在3D培養(yǎng)中優(yōu)先存活和自我組織

在21天的時間過程中，對分化的B35神經元培養(yǎng)物（約10K細胞/構建體）進行評估，以觀察其細胞形態(tài)是否與典型的神經元突起、細胞存活和在厚水凝膠床內的自我組織一致，無論是VitroGel 3D還是Matrigel，它們都接種在其上。我們使用神經元特異性標記物Beta - III - Tubulin來評估培養(yǎng)物內的關鍵形態(tài)變化。

早在分化后第3天，細胞就擴散并形成神經樣網絡，根據(jù)細胞存活、培養(yǎng)擴散和形態(tài)分析，在第7天和第9天之間，VitroGel 3D和Matrigel之間的效果相當。在Matrigel墊上，一旦第9天過去，細胞培養(yǎng)健康和活力就會急劇下降，到第14天大多數(shù)細胞分離，神經突回縮，到第21天絕大多數(shù)細胞消失。如果生長在VitroGel 3D墊上，分化的B35神經元很早就有傾向于自我組織成3D簇（第7天），在時間過程的前兩周假設為混合的2D/3D細胞培養(yǎng)。到第21天，這些細胞已經遷移到自組裝的3D簇中，嵌入到厚水凝膠基質中，簇之間的細胞很少，但沒有任何顯著的細胞死亡（圖1）。

圖1：接種在厚水凝膠墊上的長期神經元培養(yǎng)的比較。細胞用Beta - III - Tubulin（綠色）細胞骨架標記物染色，其細胞核用DAPI（藍色）復染。

長期分化的神經培養(yǎng)物在涂有VitroGel 3D - RGD的平板上的2D培養(yǎng)中存活并形成廣泛的神經突起

除了2D厚凝膠涂層方法外，B35神經元也可以在2D薄凝膠涂層方法上進行分化和維持。對于2D薄凝膠涂層培養(yǎng)，組織培養(yǎng)處理的平板用VitroGel 3D - RGD（TWG002；TheWell Bioscience。1:20稀釋）與DMEM在室溫下混合兩小時，或用Matrigel（從庫存中在DMEM中1:100稀釋；約80 - 120?g/ml）也在室溫下混合兩小時進行涂層。在兩周的過程中跟蹤細胞對表面的粘附表明，接種在VitroGel 3D - RGD上的細胞能夠很好地粘附并在撤出胎牛血清（FBS）后以典型的神經形態(tài)擴散，這會觸發(fā)B35細胞系分化為后有絲分裂神經元。在同一時間段內，也在Matrigel上進行了對照接種（圖2）。總體而言，VitroGel 3D - RGD允許細胞粘附與Matrigel相當，培養(yǎng)物能夠以類似的方式進行分化，并且在兩種情況下都觀察到了神經突延伸。VitroGel可以提供無動物源和化學定義的表面涂層，這將允許對培養(yǎng)條件進行更強的控制，并減少復雜實驗中的混雜因素。

 圖2：接種在薄2D水凝膠涂層上的長期神經元培養(yǎng)的比較。大鼠永生化B35細胞接種在VitroGel 3D - RGD或Matrigel上，通過血清撤出進行分化，并維持兩周以跟蹤神經突延伸和細胞附著。

【討論】

根據(jù)我們的結果，我們推測VitroGel 3D和Matrigel都能夠在相對較短的時間內支持細胞分化，目前使用B35細胞的大多數(shù)神經測定都是在這段時間內進行的。由于Matrigel的基質中由于其來源而含有生長因子和增殖/保護可溶性分子，因此在這種特定培養(yǎng)中可能具有輕微的優(yōu)勢，但在長期維持后期，這種趨勢似乎會逆轉，分化的B35神經元在體外第14天后從水凝膠墊上分離并漂浮。在我們的研究中，VitroGel在支持神經元長期成熟和存活方面表現(xiàn)出與Matrigel對照相當或更好的性能。這并不意外，因為Matrigel和實際上一般的3D培養(yǎng)已經被報道在傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)中提供細胞保護、增殖和成熟優(yōu)勢^[5]。

在我們的研究中，VitroGel 3D是一種完全化學定義和無動物源的水凝膠，細胞活力沒有顯著損失。這與Matrigel相比具有優(yōu)勢，Matrigel不是無動物源的，也不是化學定義的，因此如果用作厚涂層支持或與人類來源的神經元、心肌細胞等敏感細胞的全3D組織基質使用，可能會產生意想不到的副作用。由于其配方的性質，VitroGel沒有固有的預先存在的生長因子。該系統(tǒng)可以通過接種可溶性因子進一步修改以重現(xiàn)所需的生態(tài)位，并且可以以受控、可重復和定義的方式進行，這使其非常適合用于人類疾病的無動物源模型和器官模擬開發(fā)的支架。

【參考文獻】

1.Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Solomon PFD. 3D Cell Culture Systems: Advantages and Applications. J. Cell. Physiol. 2015; 230: 16–26.

2.Edmondson R, Broglie JJ, Adcock AF, Yang L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 2014; 12 (4): 207-218.

3.Fan Y, Wu J, Ashok P, Hsiung M, Tzanakakis ES. Production of Human Pluripotent Stem Cell Therapeutics Under Defined Xeno-free Conditions: Progress and Challenges. Stem cell reviews. 2015; 11 (1): 96-109.

4.Lu HF, Lim S-X, Leong MF, Narayanan K, Toh R, Gao S, Wan A. Efficient neuronal differentiation and maturation of human pluripotent stem cells encapsulated in 3D microfibrous scaffolds. Biomaterials. 2012; 33 (36): 9179-9187.

5.Baker BM, Chen CS. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell. Sci. 2012; 125: 3015-3024.