人Alpha干擾素對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞系的相對(duì)抗病毒活性，小鼠Alpha干擾素對(duì)倉(cāng)鼠和大鼠細(xì)胞系的相對(duì)抗病毒活性。

Thomas B. Lavoie, Sara Crisafulli Cabatu, Jessica Esposito, Karlene Moolchan, Lara Izotova, Sidney Pestka. PBL InterferonSource, 131 Ethel Rd West, Piscataway, NJ 08854 USA.

摘要

I型IFN亞型通常具有相對(duì)的物種選擇性，這使得跨物種實(shí)驗(yàn)難以解釋。敘利亞金倉(cāng)鼠和挪威大鼠是常見(jiàn)的嚙齒動(dòng)物模型，恒河猴和食蟹猴這兩種獼猴是常見(jiàn)的非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型，可用于多種病毒感染。來(lái)自這些物種的Alpha干擾素亞型大多不可用，因此在這些模型系統(tǒng)中經(jīng)常使用小鼠或人類(lèi)IFN亞型。為了了解哪些小鼠或人Alpha IFN亞型可用于跨物種實(shí)驗(yàn)，我們建立了恒河猴（LLC-MK2/VSV）、蟹猴（JTC-12/EMCV）、敘利亞金倉(cāng)鼠（bkh -21/VSV）和挪威大鼠（C6/VSV）細(xì)胞系的抗病毒細(xì)胞病變效應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)。在倉(cāng)鼠和大鼠細(xì)胞上測(cè)試了所有14種小鼠Alpha -IFN，在恒河鼠和食蟹細(xì)胞系上測(cè)試了所有12種人類(lèi)亞型Alpha -IFN。一般來(lái)說(shuō)，大多數(shù)小鼠IFN - Alpha亞型在其他嚙齒動(dòng)物細(xì)胞上表現(xiàn)出活性，而大多數(shù)人類(lèi)IFN - Alpha亞型在獼猴細(xì)胞上表現(xiàn)出活性。然而，有幾個(gè)值得注意的例外，某些亞型在跨種分析中很少或沒(méi)有活性。本研究結(jié)果可用于鑒定和選擇最適合用于相關(guān)動(dòng)物模型系統(tǒng)的人類(lèi)和小鼠IFN- Alpha亞型。

介紹

哺乳動(dòng)物的I型干擾素系統(tǒng)似乎是高度冗余的。這個(gè)系統(tǒng)包括各種物種的beta, epsilon, kappa, zeta 和tau。IFN-Alpha家族在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中特別大，人類(lèi)有12個(gè)成員，小鼠有14個(gè)，大鼠有18個(gè)。這種冗余的原因尚不清楚，也是許多研究的主題。

倉(cāng)鼠、大鼠、恒河猴和食蟹猴常被用作各種可能用干擾素治療的疾病的模型。沒(méi)有倉(cāng)鼠的IFN-Alpha亞型是現(xiàn)成的，只有一個(gè)大鼠，恒河猴和食蟹的IFN-Alpha亞型是可用的。

所有的人類(lèi)亞型和幾種小鼠亞型都可以在市場(chǎng)上買(mǎi)到，但關(guān)于哪些亞型可能在跨物種方式中發(fā)揮良好作用的數(shù)據(jù)很少。

我們?cè)谶@些物種衍生的細(xì)胞系中檢測(cè)了多種人類(lèi)和小鼠IFN-Alpha亞型的抗病毒作用，以努力了解哪些亞型可能適合特定的實(shí)驗(yàn)。

方法

細(xì)胞系和病毒。小鼠成纖維細(xì)胞L929 （CCL-1）、倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞BHK-21 （CCL-10）、大鼠成纖維細(xì)胞C6 （CCL-107）、人上皮細(xì)胞A549和恒河猴上皮細(xì)胞LLC-MK2 （CCL-7）細(xì)胞系均來(lái)自ATCC （Manassa, Va）。食蟹蟹上皮JTC-12 （JCRB0607）細(xì)胞系來(lái)自日本東京HSRRB。A549和JTC-12細(xì)胞的維持采用含10% FBS （Invitrogen）的DMEM。用10% FBS （Invitrogen）的Eagles MEM維持L929、BHK-21和LLC-MK2細(xì)胞，用10% FBS （Invitrogen）的F12K維持C6細(xì)胞。腦心肌炎病毒（VR-129B）和水皰性口炎病毒（VR-1238）也來(lái)自ATCC，并在Vero （CCL-81）中培養(yǎng)。

小鼠IFN-Alpha亞型的克隆與純化。所有Mu IFN-Alpha基因（表1）以密碼子和mRNA優(yōu)化形式合成，并在大腸桿菌中表達(dá)。它們是用熱休克促進(jìn)劑系統(tǒng)表達(dá)的。包涵體中發(fā)現(xiàn)的單個(gè)IFN-Alpha成熟蛋白用胍氯變性，稀釋后重新折疊，使用色譜方法（離子交換、施膠和疏水相互作用色譜相結(jié)合）純化至bb0 95%純度（圖1）。

人類(lèi)IFN-Alpha亞型均來(lái)自PBL InteferonSource庫(kù)存。

細(xì)胞病變效應(yīng)試驗(yàn)（CPE）。所有實(shí)驗(yàn)都是通過(guò)將細(xì)胞鍍?cè)谖⒌伟逯校蛊湔掣?-4小時(shí)，然后添加測(cè)試干擾素來(lái)建立的。孵育過(guò)夜后，加入EMCV或VSV的稀釋液。24-48小時(shí)后，觀察不含IFN的孔的細(xì)胞病變效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中使用的病毒原液的稀釋濃度是在時(shí)間框架內(nèi)殺死90%至100%細(xì)胞的稀釋濃度的2-4倍。活細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，并用自來(lái)水洗去多余的染料。干燥至少2小時(shí)后，用70%甲醇溶解染料，在Molecular Devices UVMax測(cè)板儀中測(cè)定562 nm處的吸光度。抑制CPE的計(jì)算方法是，將有病毒孵育但不含IFN的細(xì)胞設(shè)為100%抑制（病毒對(duì)照），將無(wú)病毒孵育的細(xì)胞設(shè)為0%抑制（細(xì)胞對(duì)照）。兩種對(duì)照均使用了6孔。通常細(xì)胞對(duì)照值是病毒對(duì)照值的6-10倍。所有樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)在兩個(gè)孔中至少進(jìn)行兩次獨(dú)立分析。

表1：本研究中使用的小鼠IFN基因和蛋白

NYA表示尚未提供。

圖1：純化的Mu IFN-Alpha蛋白純度為95%。

純化后的小鼠IFN-Alpha亞型（0.3 ~ 10 mg/L細(xì)菌培養(yǎng)）的表達(dá)量和產(chǎn)率不同。小鼠IFN-Alpha12、13、14、6T和B分別以每泳道3和1?g的濃度在12.5% SDS-PAGE上負(fù)載。

圖2：EMCV攻毒L929細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)CPE試驗(yàn)

PBL實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品（Mu IFN-Alpha a）已被校準(zhǔn)為NIH小鼠IFN-Alpha標(biāo)準(zhǔn)品（Ga02-901-511）。

圖3：小鼠IFN-Alpha12、小鼠IFN-Alpha14和大鼠IFN-Alpha1對(duì)VSV侵襲大鼠C6細(xì)胞的保護(hù)作用。

大鼠Alpha 1 IFN（pbl# 13100）對(duì)VSV攻擊的大鼠C6細(xì)胞的抗病毒活性與小鼠Alpha 12和14進(jìn)行了比較。

圖4：小鼠IFN-Alpha6T、小鼠IFN-Alpha13和人IFN-Alpha2a對(duì)敘利亞金倉(cāng)鼠BHK-21細(xì)胞VSV攻擊的保護(hù)作用

圖5：不同實(shí)驗(yàn)小鼠IFN-Alpha亞型活性的比較

表2：小鼠IFN-Alpha蛋白對(duì)L929、C6和BHK-21細(xì)胞抗病毒活性的比較

在小鼠L929細(xì)胞上，小鼠IFN-Alpha 8、9、12、14和B的活性最高。在大鼠C6細(xì)胞中，IFN-Alpha 8、11、13的活性最高；在倉(cāng)鼠BHK-21細(xì)胞中，IFN-Alpha 6T、7、9、14和B的活性最高。

總的來(lái)說(shuō)，小鼠IFN-Alpha 1,13,14和B表現(xiàn)出最好的跨物種反應(yīng)性。因此，這些將是跨物種研究的選擇。

表3：本研究中使用的人類(lèi)IFN基因和蛋白質(zhì)

圖6：選定的人IFN-Alpha亞型對(duì)A549細(xì)胞的活性 

圖7：選定的人IFN-Alpha亞型在恒河猴L(fēng)LC-MK2細(xì)胞上的活性

圖8：人、恒河猴和食蟹干擾素Alpha序列的關(guān)系

圖9：人IFN-Alpha亞型在人和猴細(xì)胞上活性的比較

表4：人IFN-Alpha蛋白對(duì)人、恒河猴和食蟹細(xì)胞抗病毒活性的比較

人類(lèi)IFN-Alpha2、5和10似乎在細(xì)胞系中具有一致的活性。IFN-Alpha1對(duì)猴細(xì)胞有較高的活性。

結(jié)論

我們已經(jīng)檢測(cè)了小鼠和人類(lèi)IFN-Alpha亞型保護(hù)異源細(xì)胞免受病毒攻擊的能力。

一些亞型在物種之間表現(xiàn)出非常明顯的缺乏交叉反應(yīng)性。

IFN-Alpha A是最容易獲得的小鼠IFN-Alpha亞型，對(duì)大鼠和敘利亞金倉(cāng)鼠細(xì)胞的活性相對(duì)較低。

小鼠IFN-Alpha 5、9和12對(duì)大鼠細(xì)胞的活性較弱，而至少9和12對(duì)倉(cāng)鼠細(xì)胞的活性較好。

人IFN-Alpha4a、4b、6和7對(duì)恒河猴細(xì)胞的活性較弱，而對(duì)食蟹細(xì)胞的活性較好。

一些IFN-Alpha亞型確實(shí)適合于涉及多物種的實(shí)驗(yàn)工作。

小鼠IFN-Alpha1和IFN-Alpha 11具有良好的跨種活性。

人類(lèi)IFN-Alpha2、5和10在被試物種中具有良好的反應(yīng)性，尤其是IFN-Alpha10對(duì)所有被試細(xì)胞都具有非常強(qiáng)的活性。

這一結(jié)果有些有趣，因?yàn)楹愫雍锖褪承泛锏幕蚪M都不包含與人類(lèi)IFN-Alpha10序列明確同源的基因。