氧化應(yīng)激研究的“黃金標(biāo)志物”

8-OHdG（8-羥基脫氧鳥苷）作為DNA氧化損傷的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，在癌癥、衰老、神經(jīng)退行性疾病等研究中具有極高價(jià)值。然而，其免疫組化（IHC）檢測(cè)常面臨物種差異大、背景干擾多、染色穩(wěn)定性差三大痛點(diǎn)，導(dǎo)致結(jié)果可靠性降低。日本免疫學(xué)會(huì)認(rèn)證抗體抗8-OHdG/8-oxo-dG單克隆抗體（貨號(hào)：MOG-020P/MOG-100P）通過系統(tǒng)性技術(shù)優(yōu)化，為您的氧化損傷研究提供跨物種、高靈敏、低背景的一站式解決方案！

1 適用物種：

適用于測(cè)試多種動(dòng)物的組織樣本，例如人、兔、大鼠等。對(duì)于來(lái)自小鼠組織樣本的小鼠IgG，需要一個(gè)額外的步驟。

2 實(shí)驗(yàn)方案：

免疫組織化學(xué)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方案見：“突破氧化損傷檢測(cè)瓶頸！抗8-OHdG抗體（克隆N45.1）IHC標(biāo)準(zhǔn)化操作指南”。

3 免疫組織化學(xué)條件：

問：8-OHdG免疫組織化學(xué)的關(guān)鍵點(diǎn)是什么？

答：染色條件應(yīng)根據(jù)樣本種類或其狀態(tài)決定。通常，正常細(xì)胞中存在10?? /dG水平的8-OHdG。許多研究報(bào)道，氧化應(yīng)激的增加會(huì)使8-OHdG的量增加幾個(gè)百分點(diǎn)或數(shù)倍。如果無(wú)法觀察到樣品與對(duì)照組織之間的明顯差異，則應(yīng)改變?nèi)旧珬l件，例如一抗的濃度或其他因素。此外，在存在羥基自由基產(chǎn)生源（如H?O?或紫外線）的情況下，正常DNA可能被氧化生成8-OHdG。請(qǐng)避免使用H?O?來(lái)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。我們推薦使用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物。染色部位主要在細(xì)胞核。

4 應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞：

問：培養(yǎng)的細(xì)胞在抗原修復(fù)過程中從載玻片上脫落。如何防止這種情況？

答：這取決于細(xì)胞類型或?qū)嶒?yàn)條件，但在某些情況下，細(xì)胞很容易從載玻片上脫落。這種情況下，推薦使用布安固定液（Bouin solution）進(jìn)行固定，以替代福爾馬林溶液。經(jīng)布安固定液固定的樣本無(wú)需抗原修復(fù)即可進(jìn)行染色。

5 內(nèi)源性生物素的封閉：

對(duì)于腎臟、肝臟、前列腺和腸道組織，可能需要封閉內(nèi)源性生物素。這種情況下，請(qǐng)?jiān)谝豢狗磻?yīng)前封閉內(nèi)源性生物素。

(1) 用0.001% 親和素 (Avidin) / PBS 孵育10-15分鐘。

(2) 用PBS洗滌。

(3) 用0.001% 生物素 (Biotin) / PBS 孵育10-15分鐘。

(4) 用PBS洗滌。

6 冰凍樣本：

抗8-OHdG單克隆抗體可能適用于冰凍切片，但未經(jīng)測(cè)試。

7 小鼠組織：（通過德州紅 (Texas red) 檢測(cè)）

(1) 封閉內(nèi)源性生物素（試劑）。

(2) 封閉內(nèi)源性小鼠IgG（MOM試劑盒）。

(3) 抗8-OHdG抗體（5 ug/mL，室溫30分鐘）。

(4) 生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體（室溫10分鐘）。

(5) 德州紅標(biāo)記的親和素 (Texas red-avidin)（10 ug/mL）。

參考文獻(xiàn)：Fujihara et.al., PLoS ONE 3(9),e3119 (2008)

8 人源培養(yǎng)細(xì)胞：（通過Fluor488檢測(cè)）

(1) 4%多聚甲醛固定。

(2) RNase 100 ug/mL, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.4M NaCl（37°C 1小時(shí)）。

(3) 蛋白酶K 10 ug/mL（室溫7分鐘）。

(4) 4N HCl處理（室溫7分鐘）。

(5) PBS中含0.2% Triton X-100。

(6) 抗8-OHdG抗體（按1:50稀釋）。

(7) Fluor488標(biāo)記的抗小鼠IgG山羊抗體（按1:200稀釋）。

參考文獻(xiàn)：Lee YA, at. al.,Biol Pharm Bull 31(6)p1265-1269(2008)

以上概述了抗8-OHdG抗體在不同樣本類型（如組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞）中的應(yīng)用關(guān)鍵點(diǎn)，包括物種適用性、防止非特異性背景的方法（如使用堿性磷酸酶系統(tǒng)替代過氧化物酶、封閉內(nèi)源性生物素和小鼠IgG）、針對(duì)不同樣本的固定與抗原修復(fù)優(yōu)化方案，并提供了來(lái)自已發(fā)表文獻(xiàn)的具體實(shí)驗(yàn)流程示例供參考。成功的染色需根據(jù)具體樣本類型和狀態(tài)優(yōu)化條件。

抗8-OHdG單抗（MOG-020P）以可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方案、跨物種的檢測(cè)能力、經(jīng)文獻(xiàn)驗(yàn)證的結(jié)果可靠性，成為氧化應(yīng)激研究者的理想工具。無(wú)論您深耕基礎(chǔ)機(jī)制，還是探索疾病關(guān)聯(lián)，它都將助您捕捉每一個(gè)DNA損傷的真相！