【介紹】 

間充質(zhì)干細胞是一種成人多能干細胞，可分化為骨、軟骨、脂肪和結(jié)締組織。在過去的二十年中，由于其廣泛的可塑性、免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性，以及相對容易從脂肪組織、骨髓、臍帶血和滑液中以患者特異性的方式分離出來，它們已成為再生醫(yī)學(xué)中胚胎干細胞的一種廣受歡迎的潛在替代品。在體外，它們已被反復(fù)證明能夠生成各種非中胚層和非間充質(zhì)組織，包括肝細胞、心肌細胞、胰腺細胞、神經(jīng)元細胞和黑素細胞。它們的免疫調(diào)節(jié)能力使它們受歡迎，不僅因為它們?yōu)橹委熞郧半y以治療的疾病（如移植物抗宿主病和器官移植）帶來了希望，而且因為與誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）和胚胎干細胞（ESC）衍生的組織相比，任何來自間充質(zhì)干細胞的組織本身幾乎不會引起免疫反應(yīng)。 然而，盡管它們具有治療潛力，但有一個主要的挫折：在體外，它們的增殖速率往往會急劇減慢，并且容易衰老，這使得它們難以擴增到足夠的治療用量。一些研究表明，調(diào)整培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度可以減輕一些衰老，但這意味著在與臨床無關(guān)的環(huán)境中培養(yǎng)細胞，這最終可能會改變它們的遺傳穩(wěn)定性。已經(jīng)對2D細胞培養(yǎng)對表達模式的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)2D培養(yǎng)往往會導(dǎo)致細胞骨架和細胞核的整體扁平化，進而導(dǎo)致基因和基因表達的改變以及細胞外基質(zhì)的重排。三維培養(yǎng)已被證明在維持細胞外基質(zhì)微環(huán)境方面更為成功，并能產(chǎn)生更均勻、可重復(fù)的結(jié)果，在包括移植在內(nèi)的臨床應(yīng)用中也取得了更多的成功。 OP9細胞是一種特征明確的小鼠骨髓基質(zhì)細胞系，由于編碼巨噬細胞集落刺激因子（M - CSF）的基因發(fā)生骨硬化突變，該細胞系不產(chǎn)生功能性M - CSF。OP9細胞最初用于與小鼠胚胎干細胞共培養(yǎng)，以誘導(dǎo)其分化為血細胞，但它們已被表征為間充質(zhì)干細胞。在這里，我們討論了在VitroGel 水凝膠系統(tǒng)上培養(yǎng)OP9的3D細胞培養(yǎng)，包括VitroGel 3D - RGD和新的VitroGel RGD - PLUS，它們含有不同水平的整合素結(jié)合配體修飾（RGD肽），用于不同的細胞 - 細胞和細胞 - 基質(zhì)相互作用。（VitroGel 3D - RGD是一種即用型可調(diào)水凝膠系統(tǒng)，用RGD細胞粘附肽修飾，促進3D細胞培養(yǎng)期間的細胞附著和細胞 - 基質(zhì)相互作用。VitroGel RGD - PLUS與常規(guī)VitroGel 3D - RGD相比，用3倍更高濃度的RGD肽修飾，即使在水凝膠稀釋后也能保持高水平的整合素結(jié)合活性，支持需要強細胞 - 細胞和細胞 - 基質(zhì)相互作用的細胞。） 材料和方法 細胞培養(yǎng) OP9細胞在添加了10％FBS和1x pen - strep的α - z低必需培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)。當培養(yǎng)物達到80 - 90％匯合時進行傳代。對于2D水凝膠涂層培養(yǎng)和3D細胞培養(yǎng)，根據(jù)用戶手冊，使用VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS，如下所述。 2D涂層培養(yǎng)方法 用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:0、1:1和1:3的稀釋度制備2D涂層水凝膠，然后與無細胞的OP9培養(yǎng)基以4:1的比例混合；向每個24孔板中加入300μl。水凝膠在室溫下穩(wěn)定20分鐘，然后將細胞添加到懸浮在300μl覆蓋培養(yǎng)基中的水凝膠頂部。每隔一天更換培養(yǎng)基。 3D涂層培養(yǎng)方法 根據(jù)制造商的方案，用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:3的稀釋度制備水凝膠。對于共聚焦/熒光成像，使用底部有蓋玻片的8孔室培養(yǎng)細胞，每孔使用200μl水凝膠。每隔一天更換培養(yǎng)基。 免疫熒光（IF）成像 由于細胞具有GFP報告基因，我們進行了活細胞成像。使用具有z堆棧功能的Leica TCS SP8掃描共聚焦顯微鏡在10X和20X放大倍數(shù)下拍攝圖像，并通過LAS X軟件和ImageJ進行處理。使用LAS X軟件和ImageJ進行圖像的處理和分析。

【結(jié)果】

在2D VitroGel培養(yǎng)中，OP9細胞表現(xiàn)出細胞聚集和健康的細胞形態(tài)。 我們在原始的VitroGel 3D - RGD和新的VitroGel RGD - PLUS中評估了2D培養(yǎng)中的OP9細胞。在組織培養(yǎng)板表面的標準2D培養(yǎng)中，OP9細胞與許多間充質(zhì)細胞類型一樣，采用成纖維細胞樣形狀，并且無法聚集（圖1A）。在這種環(huán)境中，間充質(zhì)干細胞增殖不佳，可能導(dǎo)致衰老。此外，它們在細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出與凋亡階段通常相關(guān)的特征性亮點。為了了解在我們的可調(diào)系統(tǒng)中OP9培養(yǎng)的z佳條件，我們在VitroGel的各種稀釋液中培養(yǎng)這些細胞。在VitroGel 3D - RGD中（圖1B - D），僅在細胞培養(yǎng)2天后，細胞在所有稀釋度下都形成聚集。對于更新的VitroGel RGD - PLUS（圖1E - G），細胞更加健壯，在z低稀釋度下形成大的集落并表現(xiàn)出健康的MSC形態(tài)。

圖1：OP9 - GFP細胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS的2D水凝膠涂層表面上生長。與標準2D培養(yǎng)（A）相比，OP9細胞在僅培養(yǎng)2天后在3D VitroGel環(huán)境中（B - G）附著和聚集得更好。在兩種VitroGel產(chǎn)品中，細胞在1:0稀釋度下顯示聚集（B，E），但在較低的凝膠強度物質(zhì)下，細胞在VitroGel RGD - PLUS上擴散和附著得更好。

圖2：OP9 - GFP細胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS中的三維培養(yǎng)。雖然VitroGel 3D - RGD促進細胞擴增（E，G），但新的VitroGel RGD - PLUS對OP9細胞增殖和細胞 - 細胞通信有更好的支持。

更強的細胞 - 基質(zhì)相互作用幫助細胞形成細胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（F，H）。（圖像A，B，C，D，G，H在20X；圖像E＆F在10X）。 E的3D視圖 G的3D視圖 F的3D視圖 H的3D視圖 在VitroGel RGD - PLUS中培養(yǎng)OP9細胞促進細胞間網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 這種特征在二維培養(yǎng)中通常是不可能的，并且在三維培養(yǎng)中可能會有所不同。為了了解我們的水凝膠系統(tǒng)是否能夠促進這一點，我們在三維培養(yǎng)中用我們的兩種水凝膠培養(yǎng)OP9細胞。根據(jù)我們之前的經(jīng)驗，對于3D細胞培養(yǎng)，OP9細胞更喜歡在軟的水凝膠基質(zhì)（G’ < 300 Pa）中生長。因此，本研究選擇了1:3稀釋的稀釋VitroGel水凝膠。體內(nèi)3D微環(huán)境的一個主要因素是細胞形成細胞間網(wǎng)絡(luò)的能力。在VitroGel 3D - RGD中，培養(yǎng)7天后，細胞已沉淀到3D水凝膠中（圖2C，E，G）。細胞是活的，但根據(jù)第2天和第7天的圖像比較，增殖速率較低（圖2A＆C）。圖2E和G的3D視圖顯示，在常規(guī)VitroGel 3D - RGD中培養(yǎng)7天后，OP9細胞缺乏細胞間連接。另一方面，在VitroGel RGD - PLUS中培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出更多的3D成纖維細胞樣形態(tài)，并形成了廣泛的細胞間連接（圖2D，F(xiàn)，H；圖2F和H的3D視圖）。

【討論】

 我們的研究表明，我們的新VitroGel RGD - PLUS可以成為依賴細胞間網(wǎng)絡(luò)的細胞應(yīng)用的理想三維支架。細胞分化和身份由復(fù)雜的細胞 - 細胞通信調(diào)節(jié)，這只能通過可擴散配體在短距離內(nèi)實現(xiàn)；這種行為在體外難以模擬。它可能導(dǎo)致體外和體內(nèi)研究之間的變異性，從而阻礙轉(zhuǎn)化研究。 對于組織再生，特別是間充質(zhì)分化，與周圍細胞通信的能力是絕對必要的。細胞通信通常通過細胞間的可擴散因子在相對短的距離內(nèi)發(fā)生，這得益于三維環(huán)境提供的緊密接觸。然而，更長距離的信號需要細胞通信網(wǎng)絡(luò)。多項研究表明，不同種類的支架和不同的彈性可以驅(qū)動分化沿著不同的途徑進行。VitroGel系統(tǒng)提供了一個足夠可調(diào)的平臺，以適應(yīng)任何應(yīng)用，減少變異性并簡化過程。

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