引言

癌癥的進(jìn)展高度個(gè)體化。其機(jī)制對(duì)每個(gè)動(dòng)物物種都是特定的，這使得腫瘤學(xué)研究成為生物科學(xué)中最具挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域之一。近年來(lái)，關(guān)注疾病進(jìn)展的個(gè)體化性質(zhì)的研究取得了非常有希望的進(jìn)展；例如，患者來(lái)源的異種移植（PDX）模型，其中免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)嵌入了人類來(lái)源的腫瘤組織，揭示了一些關(guān)鍵的診斷和治療信息。類似地，細(xì)胞系來(lái)源的異種移植（CDX）模型，其中使用特定的細(xì)胞系進(jìn)行移植，已被證明是研究腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的重要工具，從而推動(dòng)了癌癥治療的發(fā)展1,2。CDX模型也是藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的重要中間環(huán)節(jié)。水凝膠系統(tǒng)，如來(lái)自廣泛使用的基于動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)（AB-ECM），已經(jīng)使用了幾十年，作為體內(nèi)應(yīng)用的遞送系統(tǒng)。然而，無(wú)數(shù)未定義化合物的存在導(dǎo)致AB-ECM批次之間的不一致性。一些實(shí)際挑戰(zhàn)，如不穩(wěn)定的細(xì)胞制備、移植排斥、對(duì)聚集的恐懼或其他粘度問(wèn)題，仍然存在于當(dāng)前使用的動(dòng)物衍生基質(zhì)中。AB-ECM的溫度敏感特性也可能導(dǎo)致產(chǎn)品使用過(guò)程中的障礙。此外，AB-ECM的制造周期非常緩慢（平均4個(gè)月），這導(dǎo)致其支持異種移植研究不斷增長(zhǎng)的需求的能力問(wèn)題。為了幫助研究人員更及時(shí)、高效地推進(jìn)其臨床前研究，本應(yīng)用筆記討論了TheWell Bioscience的無(wú)外源性物質(zhì)、合成的、室溫穩(wěn)定的VitroGel?系統(tǒng)在CDX模型中的探索3。本應(yīng)用筆記具體詳細(xì)比較了在CDX小鼠模型中使用AB-ECM與VitroGel研究腫瘤特征的差異。本研究選擇了CDX模型中一些最廣泛使用的細(xì)胞類型。這些細(xì)胞類型跨越了幾個(gè)人類組織來(lái)源，包括前列腺（PC3）、宮頸（HeLa）、乳腺（HCC1806）、結(jié)腸（HCT116）、肺（Calu-6）和胰腺（PANC1）。每種細(xì)胞系在與AB-ECM或VitroGel混合后接種到小鼠體內(nèi)，以獲得腫瘤體積進(jìn)展的比較研究。

圖1. VitroGel用于異種移植應(yīng)用與基于動(dòng)物的ECM相比的優(yōu)勢(shì)比較。

關(guān)于TheWell Bioscience的VitroGel系統(tǒng)用于異種移植

TheWell Bioscience的VitroGel系統(tǒng)是一種優(yōu)秀的可注射遞送系統(tǒng)，可作為異種移植中各種細(xì)胞類型和組織的有效載體。除了無(wú)動(dòng)物源性和完全合成外，其強(qiáng)大的生物功能特性模擬組織微環(huán)境，支持細(xì)胞快速生長(zhǎng)。該產(chǎn)品具有某些關(guān)鍵屬性和優(yōu)勢(shì)，使其優(yōu)于AB-ECM和其他基質(zhì)，確保其成為卓越的替代品（圖1）。以下是一些關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：

√支持體外和體內(nèi)應(yīng)用的150多種細(xì)胞類型

√適用于具有不同宿主類型（NSG小鼠、裸鼠、SRG大鼠等）和多個(gè)注射部位（皮下、原位等）的CDX模型和PDX模型

√可重復(fù)的測(cè)定——定義明確的合成水凝膠組成，不含未知蛋白質(zhì)，無(wú)批間差異

√室溫穩(wěn)定——室溫下易于操作的方案步驟

√長(zhǎng)期可注射狀態(tài)——在室溫下保持可注射性數(shù)小時(shí)（可批量制備樣品）

√注射順暢，無(wú)針頭堵塞問(wèn)題

√注射后細(xì)胞保留良好

√始終有庫(kù)存，無(wú)供應(yīng)鏈問(wèn)題

材料和方法

細(xì)胞系和水凝膠系統(tǒng)概述

腫瘤發(fā)展研究在60只無(wú)胸腺裸鼠CDX模型中進(jìn)行。接種時(shí)選擇的小鼠年齡為6-8周。本實(shí)驗(yàn)中所有小鼠均由Charles River Laboratories提供。VitroGel水凝膠基質(zhì)（TheWell Biosciences；目錄號(hào)：VHM01）和AB-ECM作為特定腫瘤細(xì)胞系注射的遞送系統(tǒng)。六種細(xì)胞系，PC3、HCT-116、Calu-6、HCC1806、HeLa和PANC1，在與VitroGel或AB-ECM以配對(duì)方式混合后接種到小鼠體內(nèi)，每個(gè)治療組研究五只小鼠（表1）。這些細(xì)胞系跨越了幾個(gè)人類組織來(lái)源，包括前列腺、結(jié)直腸、肺、卵巢、胰腺和乳腺（表1）。在2-10周的時(shí)間內(nèi)，觀察小鼠及其腫瘤的治療組與水凝膠和AB-ECM的時(shí)間，以比較每個(gè)腫瘤達(dá)到預(yù)定腫瘤大小所需的時(shí)間。

細(xì)胞培養(yǎng)基和VitroGel與AB-ECM的處理

細(xì)胞在特定培養(yǎng)基（表1）中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞被收獲。然后將細(xì)胞重懸于PBS中，不添加更多補(bǔ)充劑。經(jīng)過(guò)一輪過(guò)濾和細(xì)胞計(jì)數(shù)后，細(xì)胞懸液隨后在335 x g RCF下進(jìn)行另一輪離心，然后使用PBS重懸細(xì)胞以獲得所需細(xì)胞濃度的2倍。

在此步驟之后，使用VitroGel與AB-ECM的方案開(kāi)始，略有變化。對(duì)于使用VitroGel的方法，首先將產(chǎn)品置于室溫下。將細(xì)胞懸液（2倍）與VitroGel以1:1（v/v）的比例混合。轉(zhuǎn)移到注射器后，將該混合物在室溫下放置10-15分鐘，在此期間交聯(lián)開(kāi)始穩(wěn)定，然后進(jìn)行注射。注射體積為100μL或200μL，具體取決于細(xì)胞類型，以獲得所需的細(xì)胞密度（1 x 10*6、2 x 10*6或10 x 10*6，具體取決于細(xì)胞類型；見(jiàn)表1）。注射在小鼠背部大腿區(qū)域附近皮下進(jìn)行。

對(duì)于AB-ECM，將溶液解凍并在整個(gè)方案中保持在4°C。然后將細(xì)胞懸液（2倍）與AB-ECM以1:1的比例（v/v）混合。同樣，裝載體積為100μL或200μL，以獲得所需數(shù)量的細(xì)胞；對(duì)于配對(duì)的VitroGel和AB-ECM實(shí)驗(yàn)，每個(gè)細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)量相等。在每輪接種后，將注射器放回冰上，以防止懸浮液凝固和針頭堵塞。協(xié)議組件的詳細(xì)信息可在下面的表1中找到。

 表1. VitroGel和AB-ECM使用的培養(yǎng)基、注射次數(shù)、體積和品系的詳細(xì)信息保持相似。

腫瘤追蹤分析

每周使用卡尺測(cè)量腫瘤大小兩次。體積以立方毫米表示，使用公式：V（mm?）=（a（長(zhǎng)度）×b（寬度）?）/2，其中a和b分別是腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑。使用Microsoft Excel計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（最多五只；個(gè)體在體重減輕超過(guò)20％、過(guò)度應(yīng)激或死亡時(shí)從研究中移除）的小鼠樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行，直到達(dá)到預(yù)定的腫瘤大小（例如1000mm?）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將動(dòng)物保持在室溫（22°C±3°C）下，濕度為50％（±20％），光照周期為12小時(shí)/12小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前獲得了適當(dāng)?shù)腎ACUC批準(zhǔn)，并遵循了所有動(dòng)物的倫理治療。

結(jié)果

根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)速度，觀察時(shí)間為2-10周。當(dāng)使用VitroGel或AB-ECM時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有六種實(shí)體瘤來(lái)源的細(xì)胞系都成功形成了實(shí)體瘤；腫瘤類型和形態(tài)相似。對(duì)于所有細(xì)胞類型，AB-ECM和VitroGel的平均生長(zhǎng)速度幾乎相似（表2；圖2）。對(duì)于所有六種細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)AB-ECM和VitroGel水凝膠達(dá)到預(yù)定腫瘤大小所需的時(shí)間相同。腫瘤生長(zhǎng)大小超過(guò)2000mm?或在任何一個(gè)維度上超過(guò)2cm的小鼠被忽略。在大多數(shù)情況下，使用VitroGel移植的腫瘤也顯示出較低的標(biāo)準(zhǔn)差，這意味著VitroGel是一個(gè)可靠的系統(tǒng)，具有較小的變異性和更高的批間一致性。這些特征證明了VitroGel水凝膠作為AB-ECM的無(wú)外源替代品的效率，使其成為具有應(yīng)用便利性的有前途的替代品。憑借長(zhǎng)期可注射狀態(tài)、批量樣品制備和易于使用的室溫操作等優(yōu)越性能，VitroGel因此成為體內(nèi)研究的強(qiáng)大工具。

 表2. VitroGel中所有六種細(xì)胞類型的腫瘤生長(zhǎng)終點(diǎn)時(shí)間和腫瘤大小。

 圖2. 所有六種細(xì)胞系的腫瘤生長(zhǎng)曲線。

討論

如圖2所示的腫瘤生長(zhǎng)曲線表明，所有測(cè)試的六種細(xì)胞類型都成功形成了實(shí)體瘤。AB-ECM和VitroGel達(dá)到預(yù)定腫瘤大小所需的時(shí)間相當(dāng)，表明VitroGel作為體內(nèi)應(yīng)用的基于動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)的有前途的替代品的功效。

除了上述六種細(xì)胞類型外，VitroGel水凝膠基質(zhì)還支持許多異種移植模型和細(xì)胞類型：乳腺（Hs578T，MDA-MB-231）、白血病（CCRF-CEM，Reh）、肺癌（A549，H2170）、黑色素瘤（A375）、胰腺（ASPC-1）、口腔（HSC-2）、纖維肉瘤（HT1080）、腎（786-O）、舌（CAL-27）等。

除了腫瘤生長(zhǎng)成功，加上注射后沒(méi)有毒性跡象，VitroGel作為一種系統(tǒng)，為癌癥科學(xué)家?guī)?lái)了許多實(shí)際好處。它有助于應(yīng)對(duì)在注射前過(guò)程中保持4°C恒定低溫的挑戰(zhàn)，使其在沒(méi)有冰或不方便使用冰時(shí)更靈活地使用。注射前均勻的細(xì)胞懸浮液，隨后是順暢的注射給藥，確保了可重復(fù)性。與AB-ECM相比，VitroGel具有批間一致性，是長(zhǎng)期分析的可靠系統(tǒng)。

該系統(tǒng)不僅旨在替代AB-ECM，還為科學(xué)家提供了控制他們希望添加的補(bǔ)充劑和生長(zhǎng)因子的能力。這種合成水凝膠系統(tǒng)允許科學(xué)家操縱關(guān)鍵的生物物理和生物學(xué)特性，如機(jī)械強(qiáng)度、功能配體和微環(huán)境的可降解性。因此，它代表了一種強(qiáng)大的生物相容性工具，讓人們能夠創(chuàng)建許多天然ECM無(wú)法做到的獨(dú)特測(cè)定。除了異種移植，可注射的VitroGel系統(tǒng)還適用于其他體內(nèi)應(yīng)用，如細(xì)胞治療、藥物遞送和傷口愈合。4-8

鏈接到使用的產(chǎn)品

1. Ready-To-Use VitroGel Hydrogel Matrix，VHM01S，VHM01

參考文獻(xiàn)

Georges, L. M. C., De Wever, O., Galván, J. A., Dawson, H., Lugli, A., Demetter, P., & Zlobec, I. (2019).?Cell Line Derived Xenograft Mouse Models Are a Suitable in vivo Model for Studying Tumor Budding in Colorectal Cancer.?Frontiers in Medicine, 6. https://doi.org/10.3389/fmed.2019.00139

Dickinson, J., de Matas, M., Dickinson, P. A., & Mistry, H. B. (2021).?Exploring a model-based analysis of patient derived xenograft studies in oncology drug development.?PeerJ, 9, e10681. https://doi.org/10.7717/peerj.10681

Xenograft | TheWell Bioscience. (n.d.). Thewellbio.com. Retrieved February 8, 2023, from https://www.thewellbio.com/applications/in-vivo/xenograft-pdx-cdx/

Xenograft – In Vivo Injection, Xeno-free Hydrogel | TheWell Bioscience. (n.d.). Thewellbio.com. Retrieved February 8, 2023, from https://www.thewellbio.com/applications/in-vivo/tissue-engineering/

Mori, H., Saeki, K., Chang, G., Wang, J., Wu, X., Hsu, P.-Y., Kanaya, N., Wang, X., Somlo, G., Nakamura, M., Bild, A., & Chen, S. (2021). Influence of Estrogen Treatment on ESR1+ and ESR1? Cells in ER+ Breast Cancer: Insights from Single-Cell Analysis of Patient-Derived Xenograft Models.?Cancers, 13(24), 6375. https://doi.org/10.3390/cancers13246375

Zhu, L., Feng, Z., Shu, X., Gao, Q., Wu, J., Du, Z., Li, R., Wang, L., Chen, N., Li, Y., Luo, M., & Wu, J. (2021).?In situ transplantation of adipose-derived stem cells via photoactivation improves glucose metabolism in obese mice.?Stem Cell Research & Therapy, 12(1). https://doi.org/10.1186/s13287-021-02494-4

Xiao, M., Qiu, J., Kuang, R., Zhang, B., Wang, W., & Yu, Q. (2019).?Synergistic effects of stromal cell-derived factor-1α and bone morphogenetic protein-2 treatment on odontogenic differentiation of human stem cells from apical papilla cultured in the VitroGel 3D system.?Cell and Tissue Research, 378(2), 207–220. https://doi.org/10.1007/s00441-019-03045-3

Wang, F., Nan, L., Zhou, S., Liu, Y., Wang, Z., Wang, J., Feng, X., & Zhang, L. (2019).?Injectable Hydrogel Combined with Nucleus Pulposus-Derived Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Degenerative Intervertebral Disc in Rats.?Stem Cells International, 2019, 1–17. https://doi.org/10.1155/2019/8496025

3D培養(yǎng)/類器官培養(yǎng)專家，艾美捷科技！

點(diǎn)擊下方單頁(yè)圖片，獲得3D培養(yǎng)于類器官培養(yǎng)指南