Thomas Nittoli等研究人員在《Cell Reports Physical Science》上發(fā)表標(biāo)題為“Site-specific antibody conjugations using bacterial transglutaminase and the Diels-Alder cycloaddition reaction”研究成果，介紹了一種兩步連續(xù)的偶聯(lián)方法，結(jié)合了細(xì)菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶/微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（mTG， Microbial Transglutaminase）的位點(diǎn)特異性和Diels-Alder（DA）化學(xué)的穩(wěn)定性，以生成具有良好物理化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定抗體偶聯(lián)物。

抗體-藥物偶聯(lián)物（ADCs）已經(jīng)成為一類強(qiáng)大的靶向生物制劑。目前所有11種美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的ADCs都是基于隨機(jī)偶聯(lián)的，但越來越多的證據(jù)表明，位點(diǎn)特異性ADCs有潛力提高治療指數(shù)。

傳統(tǒng)的制備方法仍存在一些局限性，需要進(jìn)一步改進(jìn)：

1. 隨機(jī)偶聯(lián)導(dǎo)致非均一性：傳統(tǒng)方法主要通過隨機(jī)偶聯(lián)將藥物連接到抗體上，這導(dǎo)致產(chǎn)物非均一性，藥物負(fù)載量（DAR）和抗體負(fù)載量（LAR）難以控制，影響 ADCs 的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。

2. 體外穩(wěn)定性差：一些傳統(tǒng)方法，如硫醇-馬來酰亞胺偶聯(lián)，形成的硫代縮酮鍵在體內(nèi)容易發(fā)生逆轉(zhuǎn) Michael 加成反應(yīng)，導(dǎo)致 ADCs 穩(wěn)定性下降，藥物釋放提前，從而影響療效和安全性。

3. 聚集傾向增加：氨基酸殘基的修飾，如賴氨酸和半胱氨酸的偶聯(lián)，會(huì)增加 ADCs 的聚集傾向，導(dǎo)致免疫原性增強(qiáng)，安全性降低。

4. 制備過程復(fù)雜：一些傳統(tǒng)方法需要使用危險(xiǎn)試劑或特殊條件，如疊氮化物和高能反應(yīng)，這增加了制備過程的復(fù)雜性和成本，限制了大規(guī)模生產(chǎn)。

5. 藥效窗口有限：傳統(tǒng)方法制備的 ADCs 往往存在藥物釋放不理想的問題，導(dǎo)致藥物在腫瘤組織中的濃度不足或非靶組織暴露過多，限制了藥效窗口。

   
   

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TG（mTG, Microbial Transglutaminase）-DA 偶聯(lián)方法的優(yōu)勢(shì)：

• 位點(diǎn)特異性： 通過 TG 酶（mTG, Microbial Transglutaminase）將藥物連接到抗體上的特定谷氨酰胺殘基，保證了藥物負(fù)載的均一性。

• 穩(wěn)定性： DA 環(huán)加成反應(yīng)形成的碳-碳鍵比酰胺鍵更穩(wěn)定，減少了藥物過早釋放的風(fēng)險(xiǎn)。

• 反應(yīng)條件溫和： 反應(yīng)在水相中進(jìn)行，無需使用危險(xiǎn)試劑，安全性高。

• 親水性： 偶聯(lián)產(chǎn)物相對(duì)親水，降低了聚集的風(fēng)險(xiǎn)。

• 可擴(kuò)展性： 可以用于多種藥物和抗體，并實(shí)現(xiàn)多種藥物負(fù)載模式。

• 雙偶聯(lián)： 利用分支二烯可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體進(jìn)行兩次偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)多種藥物負(fù)載模式。

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶, mTG, Microbial Transglutaminase應(yīng)用前景：

1、細(xì)胞毒性藥物 ADC：

1）抗腫瘤藥物： 將 MMAE、DM1、SN-38 等細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)到抗體上，用于靶向治療癌癥。 

2）免疫毒素： 將假單胞菌外毒素 (PE) 等免疫毒素偶聯(lián)到抗體上，用于靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

2、非細(xì)胞毒性藥物 ADC：

1）抗生素： 將利福平、萬(wàn)古霉素等抗生素偶聯(lián)到抗體上，用于靶向治療細(xì)菌感染。 

2）抗真菌藥物： 將兩性霉素 B 等抗真菌藥物偶聯(lián)到抗體上，用于靶向治療真菌感染。

3）抗病毒藥物： 將利托那韋、達(dá)蘆那韋等抗病毒藥物偶聯(lián)到抗體上，用于靶向治療病毒感染。

3、其他應(yīng)用：

1）熒光標(biāo)記： 將熒光染料偶聯(lián)到抗體上，用于免疫熒光成像。 

2）放射性標(biāo)記： 將放射性同位素偶聯(lián)到抗體上，用于放射免疫治療。

4、雙偶聯(lián) ADC：

1）多種藥物負(fù)載： 將兩種或多種藥物偶聯(lián)到抗體上，用于提高治療效果或克服耐藥性。 

2）多靶點(diǎn)治療： 將兩種或多種抗體偶聯(lián)到藥物上，用于同時(shí)靶向多個(gè)腫瘤相關(guān)抗原。

5、定制 ADC：

1）根據(jù)患者個(gè)體差異設(shè)計(jì) ADC： 例如，根據(jù)患者的腫瘤基因表達(dá)譜選擇合適的抗體和藥物進(jìn)行偶聯(lián)。

2）開發(fā)新型的 ADC 平臺(tái)： 例如，將 TG-DA 偶聯(lián)方法與其他技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出更具特異性和安全性的 ADC。  

為什么選擇微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶, mTG, Microbial Transglutaminase進(jìn)行抗體偶聯(lián)？

• 位點(diǎn)特異性：mTG, Microbial Transglutaminase能夠催化特定的氨基酸殘基（如谷氨酰胺）與含有胺基的分子之間形成穩(wěn)定的酰胺鍵。這種特異性使得TG在抗體偶聯(lián)中可以精確地在預(yù)定的位點(diǎn)引入藥物或其他分子，從而提高ADCs的均一性和療效。

• 穩(wěn)定性：與傳統(tǒng)的隨機(jī)偶聯(lián)方法相比，mTG, Microbial Transglutaminase介導(dǎo)的偶聯(lián)可以生成更穩(wěn)定的ADCs。這是因?yàn)閙TG, Microbial Transglutaminase催化的反應(yīng)生成的酰胺鍵在生理?xiàng)l件下非常穩(wěn)定，不易被水解。

• 多功能性：mTG, Microbial Transglutaminase不僅能夠偶聯(lián)小分子藥物，還能夠偶聯(lián)各種不同的分子，如熒光標(biāo)記、酶、甚至是其他蛋白質(zhì)，這為開發(fā)多功能的生物制劑提供了可能。

• 反應(yīng)條件溫和：mTG, Microbial Transglutaminase催化的反應(yīng)通常在溫和的條件下進(jìn)行，不需要極端的pH值或高能量的試劑，這有助于保持抗體的活性和穩(wěn)定性。

• 可擴(kuò)展性：mTG, Microbial Transglutaminase介導(dǎo)的偶聯(lián)方法具有很好的可擴(kuò)展性，適合從小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室研究到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)換。

• 安全性：mTG, Microbial Transglutaminase作為一種酶，其催化的反應(yīng)通常被認(rèn)為是安全的，不會(huì)產(chǎn)生有害的副產(chǎn)品。

• Zedira公司的mTG, Microbial Transglutaminase：文章中特別提到使用了Zedira公司的TG，這可能是因?yàn)樵摴咎峁┑腡G具有高純度和活性，或者具有特別適合于本研究的特定特性，如穩(wěn)定性、特異性或易于大規(guī)模生產(chǎn)等。

• 創(chuàng)新性：使用mTG, Microbial Transglutaminase進(jìn)行位點(diǎn)特異性偶聯(lián)是一種創(chuàng)新的方法，它允許研究者更精確地控制ADCs的設(shè)計(jì)，從而可能提高治療效果和減少副作用。

• 優(yōu)化潛力：mTG, Microbial Transglutaminase的活性和特異性可以通過蛋白質(zhì)工程進(jìn)行優(yōu)化，以適應(yīng)不同的偶聯(lián)需求。

• 環(huán)境友好：使用酶作為催化劑通常被認(rèn)為是一種環(huán)境友好的方法，因?yàn)樗梢栽谒嘀羞M(jìn)行，減少了有機(jī)溶劑的使用。

綜上所述，mTG, Microbial Transglutaminase的使用為抗體偶聯(lián)提供了一種高效、穩(wěn)定且具有高度特異性的方法，有助于開發(fā)更安全、更有效的治療藥物。