一、產(chǎn)品概述

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的本品為針對BubR1（BUB1B，紡錘體檢查點絲氨酸/蘇氨酸激酶B）的兔源多克隆抗體（貨號：A300-386A），經(jīng)抗原親和純化，適用于免疫沉淀（IP）及Western Blot（WB）檢測。BubR1是細(xì)胞周期紡錘體檢查點（spindle checkpoint）的核心組分，與Bub3、Mad2、Cdc20共同構(gòu)成有絲分裂檢查點復(fù)合物（MCC），通過抑制后期促進(jìn)復(fù)合物（APC）確保染色體在赤道板正確排列前不發(fā)生分離。BubR1功能異常與染色體不穩(wěn)定、非整倍體及多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。

二、關(guān)鍵規(guī)格參數(shù)

參數(shù) | 詳細(xì)信息

靶標(biāo) | BubR1（BUB1B / MAD3L）

反應(yīng)性 | 大鼠、小鼠、人

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

免疫原 | 人BubR1蛋白第350至400位氨基酸之間的區(qū)域

亞型 | IgG

純化方式 | 抗原親和純化

濃度 | 1000 ?g/ml

存儲條件 | 2 - 8 °C

保質(zhì)期 | 收貨后1年

緩沖液 | Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 7-8，含0.09%疊氮化鈉

三、免疫原與特異性識別

本抗體識別的表位位于人BubR1蛋白第350至400位氨基酸殘基之間（參考TrEMBL條目Q8WV50，GeneID 701）。該區(qū)域位于BubR1的中間區(qū)域，避開了N端的激酶結(jié)構(gòu)域和C端的PP2A結(jié)合區(qū)域，可特異性識別全長BubR1及其天然構(gòu)象。

抗體通過固相載體上固定的BubR1特異性表位進(jìn)行親和純化，確保高特異性和低背景。免疫球蛋白濃度采用比爾定律測定（1 mg/mL IgG在A280處吸光度為1.4）。

種屬交叉反應(yīng)性：已驗證反應(yīng)性包括人、小鼠、大鼠，適用于三個物種的細(xì)胞周期研究。經(jīng)測試，該抗體在人HEK293、HeLa、小鼠NIH/3T3及大鼠NRK細(xì)胞裂解液中均可檢測到預(yù)期大小的BubR1條帶（約120 kDa）。

四、應(yīng)用方法與推薦條件

4.1 Western Blot（WB）

參數(shù) | 條件

稀釋比例 | 1:2000 - 1:15,000

封閉/稀釋液 | 5% 脫脂牛奶-TBST

一抗孵育 | 過夜孵育

二抗（細(xì)胞裂解液WB） | 山羊抗兔IgG重鏈和輕鏈抗體（貨號A120-101P）

操作提示：

BubR1在細(xì)胞周期中表達(dá)水平隨細(xì)胞周期進(jìn)程波動，在G2/M期達(dá)到高峰。建議使用同步化至M期的細(xì)胞裂解液（如秋水仙胺或諾考達(dá)唑處理）作為陽性對照。

推薦起始稀釋度為1:2000。若信號過強，可上調(diào)至1:5000-1:15000。

預(yù)期條帶位置：約120 kDa。有時可觀察到較低分子量的降解條帶（常見于凋亡或老化細(xì)胞），屬于正常現(xiàn)象。

全細(xì)胞裂解液制備時建議添加蛋白酶抑制劑（如PMSF、蛋白酶抑制劑cocktail），防止BubR1降解。

4.2 免疫沉淀（IP）

參數(shù) | 條件

推薦用量 | 6 ?g 抗體 / mg 細(xì)胞裂解蛋白

操作提示：

該用量適用于人、小鼠或大鼠細(xì)胞裂解液（總蛋白濃度1-10 mg/ml）。建議使用非變性裂解緩沖液（如含150 mM NaCl、1% NP-40、50 mM Tris-HCl pH 8.0）以保持蛋白復(fù)合物完整性。

免疫沉淀后，對沉淀復(fù)合物進(jìn)行WB檢測時，必須使用抗兔IgG輕鏈HRP結(jié)合抗體（而非常規(guī)抗兔IgG H+L），以避免IP抗體的重鏈信號（約50 kDa）干擾目標(biāo)蛋白檢測。同時，在封閉液中添加5%正常豬血清（貨號S100-020）可進(jìn)一步降低非特異性背景。

建議設(shè)置同型對照兔IgG作為陰性IP對照，以排除非特異性結(jié)合。

4.3 IP-WB聯(lián)用檢測流程

對于分析BubR1與其相互作用蛋白（如Bub3、Mad2、Cdc20）的共免疫沉淀實驗，推薦以下步驟：

1. 裂解細(xì)胞（每mg總蛋白使用6 ?g抗體進(jìn)行IP）。

2. 孵育后加入蛋白A/G磁珠或瓊脂糖珠，4°C旋轉(zhuǎn)孵育2小時或過夜。

3. 洗滌珠子3-5次后，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸變性。

4. 進(jìn)行WB檢測時，一抗仍使用本抗體（A300-386A），二抗選擇抗兔IgG輕鏈HRP，避免重鏈信號（約50 kDa）遮擋目標(biāo)區(qū)域。

五、存儲與穩(wěn)定性

存儲溫度：2 - 8°C，請勿冷凍。高濃度（1000 ?g/ml）配方在冷藏條件下極為穩(wěn)定。反復(fù)開蓋取用建議分裝保存，避免污染。

保質(zhì)期：收貨后1年內(nèi)保持完整活性。

防腐劑：含0.09%疊氮化鈉，可抑制微生物污染。若下游應(yīng)用涉及HRP檢測（如WB中直接使用HRP二抗），疊氮化鈉會抑制過氧化物酶活性，需通過透析或脫鹽柱去除。對于IP實驗，疊氮化鈉通常不影響抗體與蛋白A/G的結(jié)合，但若擔(dān)心干擾，也可在裂解液中不添加額外疊氮化物。

緩沖液體系：Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液（pH 7-8），兼容多數(shù)免疫檢測體系。

本產(chǎn)品適用于細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂檢查點、染色體穩(wěn)定性及腫瘤生物學(xué)等相關(guān)研究領(lǐng)域。