AAT Bioquest的iFluor?染料經(jīng)過(guò)優(yōu)化，特別適合標(biāo)記蛋白質(zhì)，尤其是抗體。這些染料亮度高、光穩(wěn)定性好，并且在蛋白質(zhì)上幾乎不發(fā)生猝滅。它們可以被熒光儀器的主要激光線很好地激發(fā)（例如，350、405、488、555和633納米）。iFluor? 350染料的熒光激發(fā)和發(fā)射最大值分別約為345納米和450納米。這些光譜特性使它們成為AMCA和Alexa Fluor? 350標(biāo)記染料（Alexa Fluor?是Invitrogen的商標(biāo)）的極佳替代品。iFluor? 350馬來(lái)酰亞胺的穩(wěn)定性合理，并且對(duì)巰基具有良好的反應(yīng)性和選擇性。

艾美捷iFluor 350馬來(lái)酰亞胺：

貨號(hào)：AAT-1060

單位大小：1 毫克

分子量：355.34

溶劑：DMSO

校正因子（260 納米）：0.83

校正因子（280 納米）：0.23

消光系數(shù)（cm -1 M -1）：200001

激發(fā)（納米）：345

發(fā)射（納米）：450

量子產(chǎn)率：0.951

H-短語(yǔ)：H303, H313, H333

危險(xiǎn)符號(hào)：XN

預(yù)期用途：僅限研究使用（RUO）

R-短語(yǔ)：R20, R21, R22

儲(chǔ)存：冷凍（< -15 °C）；盡量減少光照暴露

庫(kù)存溶液的準(zhǔn)備：

除非另有說(shuō)明，所有未使用的庫(kù)存溶液應(yīng)在制備后分成單次使用的小份，并儲(chǔ)存在 -20 °C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

iFluor? 350 馬來(lái)酰亞胺庫(kù)存溶液（溶液 B）：

向iFluor? 350 馬來(lái)酰亞胺的瓶中加入無(wú)水DMSO，制成10 mM的庫(kù)存溶液。通過(guò)移液或渦旋混合均勻。

注意：在開(kāi)始偶聯(lián)之前準(zhǔn)備染料庫(kù)存溶液（溶液 B）。請(qǐng)立即使用。延長(zhǎng)染料庫(kù)存溶液的儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性。溶液 B 可以在避光和防潮的情況下在冷凍庫(kù)中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)4周。避免凍融循環(huán)。

蛋白質(zhì)庫(kù)存溶液（溶液 A）：

將100 ?L的反應(yīng)緩沖液（例如，pH約6.0的100 mM MES緩沖液）與900 ?L的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如，抗體，蛋白質(zhì)濃度盡可能大于2 mg/mL）混合，得到1 mL的蛋白質(zhì)標(biāo)記庫(kù)存溶液。

注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的pH值應(yīng)為6.5 ± 0.5。

注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白質(zhì)穩(wěn)定的抗體不會(huì)被很好地標(biāo)記。

注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg/mL，偶聯(lián)效率將顯著降低。為了獲得最佳的標(biāo)記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍在2-10 mg/mL之間。

可選：如果您的蛋白質(zhì)不含有游離的半胱氨酸，您必須用DTT或TCEP處理您的蛋白質(zhì)以生成巰基。DTT或TCEP用于將二硫鍵轉(zhuǎn)換為兩個(gè)游離的巰基。如果使用DTT，您必須在將染料馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)到您的蛋白質(zhì)之前，通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾去除游離的DTT。以下是生成游離巰基的示例協(xié)議：

用蒸餾水準(zhǔn)備新鮮的1 M DTT溶液（15.4 mg/100 ?L）。

在20 mM DTT中制備IgG溶液：每毫升IgG溶液中加入20 ?L的DTT庫(kù)存，同時(shí)混合。在室溫下靜置30分鐘，無(wú)需額外混合（以最小化半胱氨酸重新氧化為胱氨酸）。

將還原的IgG通過(guò)預(yù)平衡的“交換緩沖液”的過(guò)濾柱。收集柱上的0.25 mL分?jǐn)?shù)。

測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并匯集含有大部分IgG的分?jǐn)?shù)。這可以通過(guò)分光光度法或比色法完成。

在此步驟后盡快進(jìn)行偶聯(lián)（見(jiàn)樣品實(shí)驗(yàn)協(xié)議）。

注意：IgG溶液應(yīng)大于4 mg/mL以獲得最佳結(jié)果。如果抗體濃度低于2 mg/mL，則應(yīng)濃縮抗體。在緩沖液交換柱上損失額外的10%。

注意：還原可以在幾乎任何pH 7-7.5的緩沖液中進(jìn)行，例如MES、磷酸鹽或TRIS緩沖液。

注意：步驟3和4可以被透析替代。

樣品實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

這個(gè)標(biāo)記協(xié)議是為山羊抗小鼠IgG與iFluor? 350 馬來(lái)酰亞胺的偶聯(lián)而開(kāi)發(fā)的。您可能需要針對(duì)您的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。過(guò)度標(biāo)記蛋白質(zhì)可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而染料/蛋白質(zhì)比例過(guò)低的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物則靈敏度降低。

運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)：

使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例作為起點(diǎn)：將5 ?L的染料庫(kù)存溶液（溶液B，假設(shè)染料庫(kù)存溶液為10 mM）加入到蛋白質(zhì)溶液（95 ?L的溶液A）的瓶中，并有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL，蛋白質(zhì)分子量約為200KD，蛋白質(zhì)的濃度約為0.05 mM。

注意：我們建議使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例。如果太低或太高，請(qǐng)分別確定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白質(zhì)比例。

繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

純化偶聯(lián)物：

以下是一個(gè)使用Sephadex G-25柱純化染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的示例協(xié)議。

根據(jù)制造商的說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25柱。

將反應(yīng)混合物（來(lái)自“運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)”）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

當(dāng)樣品剛剛低于頂部樹(shù)脂表面時(shí)，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的樣品柱純化。合并包含所需染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的分?jǐn)?shù)。

注意：如果立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋?zhuān)⒎盅b多次使用。

注意：對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

表征所需的染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物：

取代度（DOS）是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的最重要因素。較低DOS的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強(qiáng)度，但較高DOS的蛋白質(zhì)也傾向于降低熒光。對(duì)于大多數(shù)抗體，推薦的最優(yōu)DOS在2到10之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。為了有效標(biāo)記，應(yīng)控制取代度，使每摩爾抗體有5-8摩爾的iFluor? 350 馬來(lái)酰亞胺。以下步驟用于確定iFluor? 350 馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記蛋白質(zhì)的DOS。

測(cè)量吸收：

為了測(cè)量染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的吸收光譜，建議保持樣品濃度在1-10 ?M范圍內(nèi)，具體取決于染料的消光系數(shù)。

讀取OD（吸光度）在280納米和染料最大吸收（λmax = 345納米，對(duì)于iFluor? 350染料）

對(duì)于大多數(shù)分光光度計(jì)，需要將樣品（來(lái)自柱分?jǐn)?shù)）用去離子水稀釋?zhuān)员鉕D值在0.1到0.9的范圍內(nèi)。280納米的O.D.（吸光度）是蛋白質(zhì)的最大吸收，而345納米是iFluor? 350 馬來(lái)酰亞胺的最大吸收。為了獲得準(zhǔn)確的DOS，請(qǐng)確保偶聯(lián)物中不含未偶聯(lián)的染料。

圖：HeLa細(xì)胞用小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluor 350山羊抗小鼠IgG（H+L）染色。