Rho開關(guān)通過在活性的GTP結(jié)合態(tài)和非活性的GDP結(jié)合態(tài)之間交替來發(fā)揮作用。了解調(diào)節(jié)GTP酶激活/失活的機制顯然具有生物學(xué)意義，也是當前研究的熱點。許多Rho家族效應(yīng)蛋白能夠特異性識別蛋白質(zhì)的GTP結(jié)合形式，這一特性已被實驗性地利用來開發(fā)一種強大的親和純化測定法，用于監(jiān)測RhoA蛋白的激活。該測定法使用Rho效應(yīng)蛋白Rhotekin的Rho結(jié)合域（RBD）。RBD基序已被證明能特異性結(jié)合RhoA的GTP結(jié)合形式。Rhotekin的RBD區(qū)域?qū)TPRhoA具有高親和力，并且Rhotekin的結(jié)合會導(dǎo)致GTP水解的固有速率和催化速率顯著降低，這使得它成為從細胞裂解液中親和純化GTPRhoA的理想工具。本試劑盒提供的RhotekinRBD蛋白包含Rhotekin的789位殘基，以GST融合蛋白的形式存在，這使得人們能夠利用顏色鮮艷的谷胱甘肽親和珠子“拉下”RhotekinRBD/RhoGTP復(fù)合物。因此，該測定法提供了一種簡單的方法來定量檢測細胞中RhoA的激活。通過使用特異性針對RhoA的抗體進行Westernblot來確定激活的RhoA的量。

艾美捷RhoA Pulldown活化檢測試劑盒（#BK036S）試劑盒內(nèi)容：

根據(jù)測定設(shè)置，該試劑盒包含足夠進行20次測定的材料，并包括用于陽性和陰性對照的試劑。還有可供進行80次測定的較大版本試劑盒，貨號為BK036。包含以下組分：

#RT02：帶有顏色的瓊脂糖珠子上的GST標簽RhotekinRBD蛋白

#ARH03：RhoA特異性單克隆抗體

#RH01：His標簽RhoA蛋白

#BS01：GTPγS（非水解性GTP類似物）

GDP

細胞裂解緩沖液

洗滌緩沖液

上樣緩沖液

停止緩沖液

貨號PIC02：蛋白酶抑制劑混合液

附有詳細操作步驟和廣泛的故障排除指南的手冊

所需設(shè)備

SDSPAGE迷你凝膠系統(tǒng)和Westernblot轉(zhuǎn)移裝置

實驗結(jié)果示例：

圖1：試劑盒BK036S中顏色鮮艷的谷胱甘肽瓊脂糖珠子使其易于使用。

通過在細胞裂解液中加載RhoA蛋白，分別使用GTPγS或GDP來測試RhoA激活測定法。正如預(yù)期的那樣，加載了GTPγS的RhoA被非常高效地沉淀，而加載了GDP的RhoA沉淀量很少（見圖2）。

圖2：使用試劑盒BK036S進行RhoA激活測定的結(jié)果。激活的Rho通過Westernblot檢測，使用試劑盒BK036S進行沉淀。第一泳道顯示50納克重組His標簽RhoA標準品（Rec.HisRhoA）。接下來的泳道顯示從等量細胞裂解液中沉淀的非活性、GDP加載的RhoA（RhoAGDPPD）或活性、GTPγS加載的RhoA（RhoAGTPPD）。

GLISA 產(chǎn)品

Cdc42 GLISA? 激活測定試劑盒，比色法（貨號：BK127）  

Rac1 GLISA? 激活測定試劑盒，發(fā)光法（貨號：BK126）  

Rac1,2,3 GLISA? 激活測定試劑盒，比色法（貨號：BK125）  

RhoA GLISA? 激活測定試劑盒，比色法（貨號：BK124）  

RhoA GLISA? 激活測定試劑盒，發(fā)光法（貨號：BK121）  

相關(guān)產(chǎn)品

抗Cdc42單克隆抗體（貨號：ACD03）  

抗Rac1單克隆抗體（貨號：ARC03）  

抗RhoA單克隆抗體（貨號：ARH03）