SiR-actin 基于硅羅丹明（SiR）熒光團(tuán)和肌動(dòng)蛋白結(jié)合天然產(chǎn)物雅斯普霉素（jasplakinolide）。SiR-actin 可在活細(xì)胞中特異性地標(biāo)記 F-肌動(dòng)蛋白，背景低（1）。SiR-actin 的關(guān)鍵特性包括：i）遠(yuǎn)紅光吸收和發(fā)射波長(zhǎng)；ii）細(xì)胞通透性；iii）熒光生成特性；iv）與超分辨率顯微鏡技術(shù)（STED 和 SIM）兼容。這些特性在一個(gè)探針中的獨(dú)特組合使 SiR-actin 處于卓越的前沿。

艾美捷SiR-肌動(dòng)蛋白試劑盒（#CY-SC001）物理性質(zhì)：

- 吸收波長(zhǎng)（abs）：652 nm  

- 發(fā)射波長(zhǎng)（Em）：674 nm  

- 摩爾吸光系數(shù)（ε652 nm）：1.0×105 mol-1·cm-1  

- 分子量（MW）：1241.6 g/mol  

- 分子式（MF）：C71H88N8O10Si  

儲(chǔ)存與操作

收到后請(qǐng)將化合物保存在 -20°C 以下。使用無(wú)水 DMSO 配制化合物溶液。使用后請(qǐng)將溶液保存在 -20°C 以下。在打開(kāi)小瓶之前，應(yīng)讓其恢復(fù)至室溫。如果儲(chǔ)存得當(dāng)，化合物應(yīng)可在數(shù)月內(nèi)保持穩(wěn)定。注意：DMSO 溶液應(yīng)特別小心處理，因?yàn)?nbsp;DMSO 已知會(huì)促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。請(qǐng)按照所有相關(guān)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理這些試劑。

注意：本協(xié)議是使用貼附在蓋玻片上的人類成纖維細(xì)胞優(yōu)化的，并已在其他常見(jiàn)細(xì)胞系中得到確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)協(xié)議的建議應(yīng)作為起點(diǎn)，每種細(xì)胞類型的最優(yōu)標(biāo)記條件應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。SiR-actin 基于肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定藥物雅斯普霉素。因此，它可以改變活細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)。盡管在高達(dá) 3 ?M 的 SiR-actin 濃度下，有絲分裂持續(xù)時(shí)間保持不變，但在培養(yǎng)的 HeLa 細(xì)胞中，超過(guò) 100 nM 的濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖指數(shù)降低（1）。如果計(jì)劃進(jìn)行長(zhǎng)期成像實(shí)驗(yàn)，且肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)至關(guān)重要，我們建議將 SiR-actin 的濃度保持在 100 nM 或以下。對(duì)于其他用途，建議使用 1 ?M 的 SiR-actin 進(jìn)行染色。

配制 1 mM 儲(chǔ)備液

將 SiR-actin 小瓶中的內(nèi)容物溶解在 50 ?L 無(wú)水 DMSO 中，制備 1 mM 儲(chǔ)備液。此溶液應(yīng)保存在 -20°C 或以下。不要將溶液分裝成小份量，因?yàn)樗鼈儠?huì)更快降解，且該化合物不會(huì)因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲(chǔ)存得當(dāng)，此儲(chǔ)備液應(yīng)可在三個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。如果需要精確測(cè)定儲(chǔ)備液的濃度，將 1 ?L 1 mM 儲(chǔ)備液稀釋在含有 0.2% SDS 的 99 ?L PBS 中。在室溫下靜置 15 分鐘后，測(cè)量 652 nm 處的吸光度。使用上述摩爾吸光系數(shù)計(jì)算濃度。

配制染色液

將 SiR-actin 稀釋到所需的濃度，加入細(xì)胞培養(yǎng)基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暫渦旋。由于染色效率可能因細(xì)胞系而異，建議首次嘗試時(shí)使用 1 ?M 的濃度，以快速獲得強(qiáng)染色效果，然后在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中逐步降低 SiR-actin 的濃度，直至達(dá)到最佳染色效果（見(jiàn)下表中的標(biāo)記濃度和孵育時(shí)間）。某些細(xì)胞系可能表達(dá)高水平的外排泵，導(dǎo)致 SiR-actin 染色效果不佳。在染色液中加入 10 ?M 的維拉帕米（一種廣譜外排泵抑制劑）通常會(huì)顯著改善染色效果。僅使用新配制的染色液，不要重復(fù)使用。

細(xì)胞準(zhǔn)備與染色

按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時(shí)，用染色液替換培養(yǎng)基，確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋。將細(xì)胞置于 37°C、含 5% CO? 的濕潤(rùn)環(huán)境中孵育，并根據(jù)下表確定標(biāo)記時(shí)間與探針濃度的關(guān)系：

細(xì)胞成像： 

SiR-actin 的成像最好使用標(biāo)準(zhǔn)的 Cy5 設(shè)置。標(biāo)記后，活細(xì)胞可以立即成像，無(wú)需洗滌步驟。可選地，用不含探針的新鮮培養(yǎng)基替換一次標(biāo)記液，通常可以提高信噪比。如果進(jìn)行時(shí)間序列成像，建議在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將探針濃度保持在 100 nM 或以下，以獲得穩(wěn)定的信號(hào)并避免探針對(duì)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)產(chǎn)生干擾（細(xì)胞增殖減少）。如果在成像前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了洗滌，染色效果可維持?jǐn)?shù)小時(shí)。

SiR-肌動(dòng)蛋白試劑盒文獻(xiàn)參考：

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavi?ius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)