SiR-DNA基于硅羅丹明（SiR）熒光團(tuán)和DNA小溝結(jié)合劑雙苯咪唑（Hoechst）。SiR-DNA可在活細(xì)胞中特異性地標(biāo)記DNA，背景低（1）。SiR-DNA的關(guān)鍵特性包括：i）遠(yuǎn)紅光吸收和發(fā)射波長；ii）細(xì)胞通透性；iii）熒光生成特性；iv）與超分辨率顯微鏡技術(shù)（STED和SIM）兼容。這些特性在一個(gè)探針中的獨(dú)特組合使SiR-DNA處于卓越的前沿。

艾美捷SiR-DNA試劑盒（#CY-SC007）物理性質(zhì)：

-吸收波長（Abs）：652nm

-發(fā)射波長（Em）：674nm

-最大摩爾吸光系數(shù)（εmax）：1.0×10?mol??·cm??

-分子量（MW）：950.2g/mol

-分子式（MF）：C56H59N9O4Si

儲存與操作

收到后請將化合物保存在-20°C以下。使用無水DMSO配制化合物溶液。使用后請將溶液保存在-20°C以下。在打開小瓶之前，應(yīng)讓其恢復(fù)至室溫。如果儲存得當(dāng)，化合物應(yīng)可在數(shù)月內(nèi)保持穩(wěn)定。注意：DMSO溶液應(yīng)特別小心處理，因?yàn)镈MSO已知會促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。請按照所有相關(guān)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理這些試劑。

標(biāo)記協(xié)議：

注意：本協(xié)議是使用貼附在蓋玻片上的人類成纖維細(xì)胞優(yōu)化的，并已在其他常見細(xì)胞系中得到確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)協(xié)議的建議應(yīng)作為起點(diǎn)，每種細(xì)胞類型的最優(yōu)標(biāo)記條件應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定。SiR-DNA基于DNA小溝結(jié)合分子雙苯咪唑。因此，它可以改變活細(xì)胞中的DNA代謝。在高達(dá)10?M的SiR-DNA濃度下，有絲分裂持續(xù)時(shí)間和染色體錯(cuò)誤分離保持不變。然而，一項(xiàng)獨(dú)立研究（1）使用CyclinB1和γH2AX報(bào)告基因檢測建議，如果計(jì)劃進(jìn)行長期（>12小時(shí)）成像實(shí)驗(yàn)，建議使用250nM或以下濃度的SiR-DNA。對于所有其他用途，建議使用1-3?M的SiR-DNA進(jìn)行染色。

配制1mM儲備液：

將SiR-DNA小瓶中的內(nèi)容物溶解在50?L無水DMSO中，制備1mM儲備液。此溶液應(yīng)保存在-20°C或以下。不要將溶液分裝成小份量，因?yàn)樗鼈儠旖到猓以摶衔锊粫蚨啻蝺鋈谘h(huán)而改變。如果儲存得當(dāng)，此儲備液應(yīng)可在三個(gè)月或更長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。如果需要精確測定儲備液的濃度，將1?L1mM儲備液稀釋在含有0.2%SDS的99?LPBS中。在室溫下靜置15分鐘后，測量652nm處的吸光度。使用上述摩爾吸光系數(shù)計(jì)算濃度。

配制染色液：

將SiR-DNA稀釋到所需的濃度，加入細(xì)胞培養(yǎng)基（例如DMEM+10%胎牛血清）中，并短暫渦旋。由于染色效率可能因細(xì)胞系而異，建議首次嘗試時(shí)使用3?M的濃度，以快速獲得強(qiáng)染色效果，然后在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中逐步降低SiR-DNA的濃度，直至達(dá)到最佳染色效果（見下表中的標(biāo)記濃度和孵育時(shí)間）。某些細(xì)胞系可能表達(dá)高水平的外排泵，導(dǎo)致SiR-DNA染色效果不佳。在染色液中加入1-10?M的維拉帕米（一種廣譜外排泵抑制劑）通常會顯著改善染色效果。

細(xì)胞準(zhǔn)備與染色：

按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時(shí)，用染色液替換培養(yǎng)基，確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋。將細(xì)胞置于37°C、含5%CO?的濕潤環(huán)境中孵育，并根據(jù)下表確定標(biāo)記時(shí)間與探針濃度的關(guān)系：

注意：SiR-DNA可以對用甲醛（PFA）和甲醇固定的細(xì)胞進(jìn)行染色。

細(xì)胞成像：

SiR-DNA的成像最好使用標(biāo)準(zhǔn)的Cy5設(shè)置。標(biāo)記后，活細(xì)胞可以立即成像，無需洗滌步驟。可選地，用不含探針的新鮮培養(yǎng)基替換一次標(biāo)記液，通常可以提高信噪比。如果進(jìn)行時(shí)間序列成像，建議在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中將探針濃度保持在1?M或以下，以獲得穩(wěn)定的信號并避免探針對DNA代謝產(chǎn)生干擾。如果在成像前對細(xì)胞進(jìn)行了洗滌，染色效果可維持?jǐn)?shù)小時(shí)。請注意，SiR-DNA可能會被360-390nm的光激發(fā)，并由于探針的DNA結(jié)合部分的熒光而在大約450nm處產(chǎn)生一些熒光。

SiR-DNA試劑盒文獻(xiàn)參考：

1. Sen, Onur, Adrian T. Saurin, and Jonathan MG Higgins.; Scientific reports 8.1 (2018): 7898