RARα熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系是經(jīng)過工程改造的HEK293細(xì)胞，表達(dá)受視黃酸反應(yīng)元件（RARE）控制的條件性螢火蟲熒光素酶報告基因，并持續(xù)表達(dá)全長人類視黃酸受體α（RARα, NM_0.00964）。該細(xì)胞系已功能驗證，能響應(yīng)全反式視黃酸（ATRA）刺激。

圖1：RARα/RARα熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系中視黃酸依賴性熒光素酶報告基因的激活。

背景：

視黃酸受體（RAR）屬于核受體家族，有三種亞型：RARα、RARβ和RARγ。RAR與視黃酸X受體（RXR）異二聚化，并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)正常和惡性細(xì)胞的生長和分化。當(dāng)RAR與其配體結(jié)合，全反式視黃酸（ATRA）或9-順式視黃酸時，RAR/RXR異二聚體結(jié)合到目標(biāo)基因啟動子區(qū)域的視黃酸反應(yīng)元件。這會招募共激活蛋白，導(dǎo)致下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。視黃酸（維生素A的衍生物）信號在胚胎和免疫系統(tǒng)發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色。RARα的突變可能導(dǎo)致急性早幼粒細(xì)胞性白血病（APL），其特征是血液中的前體細(xì)胞（早幼粒細(xì)胞）積累，以及其他類型的癌癥。視黃酸的使用可能在癌癥治療中證明是有益的。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品RARα 熒光素酶報告基因 HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用：

- 監(jiān)測RARα調(diào)控的信號通路活性。

- 篩選RARα的激動劑和拮抗劑。

細(xì)胞解凍：

1. 在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中的內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基6的管中。在37°C水浴中放置細(xì)胞太久會導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基6中重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)48-72小時后，檢查細(xì)胞活力，更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基6，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細(xì)胞應(yīng)在達(dá)到100%融合前傳代。傳代時切換到生長培養(yǎng)基6A。

細(xì)胞傳代：

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并按照所用培養(yǎng)容器推薦的體積用0.25% Trypsin/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基6A并轉(zhuǎn)移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長培養(yǎng)基6A中重懸細(xì)胞。

4. 按照推薦的次培養(yǎng)比例1:10至1:20每周兩次將細(xì)胞種植到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍：

1. 分離后，以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘。

2. 去除培養(yǎng)基，并在4°C細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞，密度約為2 x 10^6細(xì)胞/ml。

3. 將1毫升的細(xì)胞懸浮液分裝到每個冷凍瓶中。將瓶子放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

4. 次日將瓶子轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長期存儲。

注意：建議擴(kuò)展細(xì)胞并在早期傳代時至少冷凍10瓶細(xì)胞以備將來使用。

檢測培養(yǎng)基：

檢測培養(yǎng)基6A。

1. 在種植細(xì)胞前24小時，去除生長培養(yǎng)基6A并替換為檢測培養(yǎng)基。

2. 將細(xì)胞分散并種植約30,000細(xì)胞/孔在90 ?l的檢測培養(yǎng)基中于96孔白色透明底板中。

3. 在“細(xì)胞自由對照”孔中加入90 ?l的檢測培養(yǎng)基（用于確定背景發(fā)光）。

4. 準(zhǔn)備ATRA（每孔10 ?l）：首先在100% DMSO中準(zhǔn)備ATRA的庫存溶液，濃度為期望最高濃度的2000倍。最終體積為100 ?l。

   在檢測培養(yǎng)基中稀釋200倍，準(zhǔn)備含0.5% DMSO的中間10倍庫存溶液。

   在0.5% DMSO的檢測培養(yǎng)基中準(zhǔn)備ATRA的連續(xù)稀釋液，濃度比期望的最終濃度高10倍。準(zhǔn)備含0.5% DMSO的檢測培養(yǎng)基（稀釋液）用于對照（稀釋液）。

   注意：檢測中DMSO的最終濃度不應(yīng)超過0.1%。

5. 向每個孔中加入10 ?l稀釋的ATRA。

6. 向“未刺激對照”孔和“細(xì)胞自由對照”孔（背景）中加入10 ?l稀釋液。

7. 在37°C、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞約16至24小時。

8. 每孔加入100 ?l的ONE-Step?熒光素酶試劑，并在室溫下輕輕搖動約15分鐘。

9. 使用發(fā)光儀測量發(fā)光。

10. 從所有孔的發(fā)光讀數(shù)中減去平均背景發(fā)光（無細(xì)胞對照孔）。通過將ATRA刺激的發(fā)光與未刺激對照發(fā)光相除，可以計算RARα熒光素酶報告基因表達(dá)的倍數(shù)誘導(dǎo)。

文獻(xiàn)參考：

Petkovich M., et al., 1987 Nature. 330 (6147):440-50.

Allenby J., et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 (1):30-4.

Peng Z., et al., 2023 J Immunotherapy Cancer 11 (3): e006325.

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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