RARβ熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系是一種經(jīng)過工程改造的HEK293細(xì)胞系，表達(dá)由視黃酸反應(yīng)元件控制的螢火蟲熒光素酶，并含有全長人類RARβ（登錄號(hào)#P10826-2）。RARβ熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系旨在監(jiān)測RARβ的活性。該細(xì)胞系通過全反式視黃酸（ATRA）刺激進(jìn)行了功能性驗(yàn)證。

圖1：RARγ熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系的作用機(jī)制圖示。在視黃酸激活后，RAR與RXR二聚化，并激活RARE和熒光素酶表達(dá)。激活水平與熒光素酶信號(hào)直接對應(yīng)。

背景：

視黃酸受體（RAR）屬于核受體家族，有三種亞型，即RARα、RARβ和RARγ。RAR與視黃酸X受體（RXR）異二聚化，并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)正常和惡性細(xì)胞的生長和分化。當(dāng)RAR與其配體結(jié)合，全反式視黃酸或9-順式視黃酸時(shí)，RAR/RXR異二聚體結(jié)合到目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的視黃酸反應(yīng)元件，并招募共激活蛋白，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和下游目標(biāo)基因的表達(dá)。RARβ功能障礙可能導(dǎo)致宮頸癌。異常的啟動(dòng)子DNA高甲基化也與癌癥有關(guān)。

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應(yīng)用：

- 監(jiān)測RARβ調(diào)控的信號(hào)通路活性。

- 篩選RARβ的激動(dòng)劑或拮抗劑。

細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議：

細(xì)胞解凍：

1. 在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中的內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基6的管中。在37°C水浴中放置細(xì)胞太久會(huì)導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基6中重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基6，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細(xì)胞應(yīng)在完全融合前傳代。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基6A。

細(xì)胞傳代：

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基6A并轉(zhuǎn)移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長培養(yǎng)基6A中重懸細(xì)胞。

4. 按照推薦的次培養(yǎng)比例1:10至1:20每周兩次將細(xì)胞種植到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍：

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基1G并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度約為2 x 10^6細(xì)胞/ml。

4. 將1毫升的細(xì)胞懸浮液分裝到每個(gè)冷凍瓶中。將瓶子放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將瓶子轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長期存儲(chǔ)。

注意：建議擴(kuò)展細(xì)胞并在早期傳代時(shí)至少冷凍10瓶細(xì)胞以備將來使用。

圖2：RARβ熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系對全反式視黃酸（ATRA）的劑量反應(yīng)曲線。細(xì)胞與逐漸增加的ATRA孵育。使用ONE-Step?熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶活性。結(jié)果以RAR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的倍數(shù)誘導(dǎo)顯示。

文獻(xiàn)參考：

Petkovich M., et al., 1987 Nature 330(6147): 444-450.

Allenby G., et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1): 30-34.

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