Notch1/CSL熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系是一種HEK293細(xì)胞系，表達(dá)由Notch反應(yīng)元件（CSL反應(yīng)元件）控制的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因，以及表達(dá)Notch1ΔE（整個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域被刪除的Notch1）。在細(xì)胞內(nèi)，Notch1ΔE可以被γ-分泌酶切割。這種活躍的Notch1 NICD（Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并誘導(dǎo)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。該細(xì)胞系已通過使用已知的Notch信號(hào)通路抑制劑來驗(yàn)證熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的抑制。

背景：

Notch信號(hào)通路控制脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物組織中的細(xì)胞命運(yùn)決定，并參與胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)以及免疫和血管生成系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。Notch信號(hào)通過與存在于相對(duì)細(xì)胞中的跨膜配體結(jié)合到四個(gè)現(xiàn)有的Notch跨膜受體之一（Notch1/Notch2/Notch3/Notch4）來觸發(fā)。這導(dǎo)致Notch受體的蛋白水解切割，釋放Notch受體的恒定活躍的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）。NICD轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與轉(zhuǎn)錄因子CSL（CBF1/RBPJκ/無毛抑制因子/Lag-1）和共激活因子Mastermind結(jié)合，啟動(dòng)Notch反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。Notch信號(hào)的功能障礙有嚴(yán)重后果，包括發(fā)育病理或癌癥（如T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病、T-ALL和尿路上皮膀胱癌）。作為癌癥治療選項(xiàng)以及在組織再生中使用Notch抑制劑，主要是γ-分泌酶抑制劑，正在進(jìn)行中。進(jìn)一步的研究將使我們更深入地理解Notch信號(hào)，并有利于未來的治療途徑。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品Notch1/CSL 熒光素酶報(bào)告基因 HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用：

- 監(jiān)測Notch信號(hào)通路活性。

- 在細(xì)胞模型中篩選Notch信號(hào)通路的抑制劑。

細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議：

細(xì)胞解凍：

1. 從液氮存儲(chǔ)中取出一個(gè)細(xì)胞瓶。在準(zhǔn)備好解凍之前，將其保存在干冰上。

2. 準(zhǔn)備好解凍時(shí)，在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。一旦細(xì)胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到一個(gè)空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C水浴中放置細(xì)胞太久會(huì)導(dǎo)致活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學(xué)移液管，慢慢地向含有細(xì)胞的錐形管中加入10毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1。解凍培養(yǎng)基1應(yīng)該滴加，同時(shí)輕輕搖晃錐形管，以實(shí)現(xiàn)溫和混合，避免滲透沖擊。

4. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸細(xì)胞。

5. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好分裂。

7. 細(xì)胞應(yīng)在完全融合前分裂。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基1A。

細(xì)胞傳代：

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基1A并轉(zhuǎn)移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長培養(yǎng)基1A中重懸細(xì)胞。

4. 按照推薦的次培養(yǎng)比例1:10每周一次或兩次將細(xì)胞種植到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍：

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基1A并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度約為2 x 10^6細(xì)胞/ml。

4. 將1毫升的細(xì)胞懸浮液分裝到每個(gè)冷凍瓶中。將瓶子放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將瓶子轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長期存儲(chǔ)。

注意：建議擴(kuò)展細(xì)胞并在早期傳代時(shí)至少冷凍10瓶細(xì)胞以備將來使用。

圖1：Notch1/CSL熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系對(duì)DAPT（一種Notch通路抑制劑）的響應(yīng)。

DAPT抑制Notch1/CSL熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)。CSL報(bào)告基因HEK293細(xì)胞用作對(duì)照。CSL報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系包含由Notch反應(yīng)元件（CSL反應(yīng)元件）控制的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因，但不表達(dá)Notch1ΔE，因此無法表達(dá)Notch熒光素酶報(bào)告基因。活性使用ONE-Step?熒光素酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行測量。

文獻(xiàn)參考：

1. Lu F.M., et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(11): 5663-5667.

2. Kanungo J., et al., 2008 J. Neurochem. 106: 2236-48.

3. Cao L. et al., 2023 Blood Adv. 10.1182/bloodadvances.2023010380

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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