描述

重組穩(wěn)定HEK293細胞系，持續(xù)表達ZsGreen（來自Zoanthus sp. 珊瑚的亮綠色熒光蛋白）和螢火蟲熒光素酶，這些基因已通過CRISPR/Cas9穩(wěn)定整合到染色體19上的AAVS1安全港位點。ZsGreen和熒光素酶報告基因的表達由EF1A啟動子驅動。通過限制稀釋法篩選獲得單克隆群體。ZsGreen/熒光素酶沒有隨機整合到HEK293基因組中，保證了這個細胞系的行為與親本HEK293細胞相似。

背景

人類染色體19上的AAVS1（也稱為PPP1R12C位點）是一個經過充分驗證的“安全港”位點，用于承載DNA轉基因。AAVS1具有開放的染色質結構，并且具有轉錄能力。最重要的是，使用CRISPR/Cas9插入DNA轉基因破壞AAVS1位點對細胞沒有已知的不良影響。特別針對AAVS1位點是一個主要優(yōu)勢，與使用其他方法（如慢病毒感染或細胞轉染）獲得的隨機整合相比，后者可能會引起插入性突變或破壞重要基因或細胞過程。生成同時含有熒光標記和熒光素酶的細胞系，允許在多種檢測類型中輕松讀取結果，從體外到體內應用。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦BPS Bioscience熱銷產品ZsGreen/熒光素酶安全港 HEK293 細胞系。產品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應用

? 用作基于細胞的檢測中的對照。

? 用作進一步遺傳修飾的興趣基礎細胞系模型。

細胞培養(yǎng)協(xié)議

注意：HEK293細胞源自人類材料，因此建議采取適當?shù)陌踩A防措施。

細胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃冷凍細胞瓶大約60秒。一旦細胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中全部內容物轉移到含有10毫升預溫的解凍培養(yǎng)基6的試管中。在37°C水浴中放置過久會導致細胞活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預溫的解凍培養(yǎng)基6中重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細胞附著和活性。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基6，并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細胞，直到準備好傳代。

5. 細胞應在完全融合前傳代。

細胞傳代

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入解凍培養(yǎng)基6并轉移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在解凍培養(yǎng)基6中重懸細胞。

4. 按照推薦的次培養(yǎng)比例1:6至1:8，每周一次或兩次接種到新的培養(yǎng)容器中。

細胞冷凍

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入解凍培養(yǎng)基6并計數(shù)細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C的細胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細胞至約2 x 10^6細胞/毫升。

4. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。

5. 將小瓶放置在保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

6. 次日將小瓶轉移到液氮中進行長期儲存。

數(shù)據(jù)展示：

圖：PCR擴增整合到HEK293細胞基因組中的轉基因。

在整合的5'端，跨越染色體19 AAVS1位點和啟動子整合開始的區(qū)域通過PCR擴增，預計大小為1.1 kb。在整合的3'端，跨越SV40 Poly A信號區(qū)域整合和染色體19 AAVS1位點的區(qū)域通過PCR擴增，預計大小為1.2 kb。

文獻參考：

RFP/GFP Safe-Harbor HEK293 Cell Line 78581 2 vials

Cas9/GFP Safe-Harbor Hek293 Cell Line 78582 2 vials

AAV-DJ ZsGreen 78442 50 μl x 2

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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