描述

全長(zhǎng)Notch1/CSL熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系是一種表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的HEK293細(xì)胞系，該報(bào)告基因受Notch響應(yīng)元件（CSL響應(yīng)元件）和全長(zhǎng)Notch1（登錄號(hào)：NM_017617.5）的控制。在配體-受體相互作用后，Notch1受體被γ-分泌酶切割。這種活躍的Notch1 NICD（Notch細(xì)胞內(nèi)域）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并誘導(dǎo)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。

該細(xì)胞系在DAPT和DLL4的作用下，對(duì)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的激活和抑制都進(jìn)行了功能性驗(yàn)證。

背景

Notch信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守，在癌癥中作為維持癌癥干細(xì)胞特性和誘導(dǎo)腫瘤血管生成的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素發(fā)揮著重要作用。哺乳動(dòng)物擁有四種不同的單跨膜Notch受體，即Notch1-4。Notch配體有兩個(gè)家族的跨膜蛋白，包括Delta樣配體（DLL1、DLL3和DLL4）和Jagged（JAG1和JAG2）。Notch信號(hào)通路由配體-受體結(jié)合啟動(dòng)，經(jīng)歷由ADAM（含血栓素結(jié)構(gòu)域的解聚素和金屬蛋白酶）家族蛋白酶和γ-分泌酶進(jìn)行的兩步蛋白水解切割。釋放的Notch細(xì)胞內(nèi)域（NICD）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子RBP-J（CSL）、mastermind-like（MAML）蛋白和其他共激活蛋白的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體相互作用，以刺激Notch靶基因的表達(dá)。Notch信號(hào)通路可以通過(guò)兩大類(lèi)Notch抑制劑阻斷：小分子γ-分泌酶抑制劑和特異性結(jié)合Notch配體或受體的單克隆抗體。Notch信號(hào)參與多種組織和器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)。Notch信號(hào)的功能障礙有嚴(yán)重后果，包括發(fā)育病理或癌癥（如T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病、T-ALL和尿路上皮膀胱癌）。Notch抑制劑的使用，主要是γ-分泌酶抑制劑，作為癌癥治療選項(xiàng)和組織再生正在進(jìn)行中。進(jìn)一步的研究將使我們對(duì)Notch信號(hào)有更深入的理解，并將有利于未來(lái)的治療途徑。

作為BPS Bioscience在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷(xiāo)產(chǎn)品全長(zhǎng) Notch1/CSL 熒光素酶報(bào)告基因 HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

? 篩選和驗(yàn)證針對(duì)Notch1的抗體，用于藥物發(fā)現(xiàn)和免疫治療研究。

? 在細(xì)胞模型中篩選Notch信號(hào)通路的小分子抑制劑。

? 進(jìn)行配體/受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，篩選潛在的Notch1通路抑制劑。

細(xì)胞解凍

1. 從液氮儲(chǔ)存中取出一個(gè)細(xì)胞瓶。在準(zhǔn)備解凍前保持在干冰上。

2. 準(zhǔn)備解凍時(shí)，在37°C水浴中搖晃冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。一旦細(xì)胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中全部?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個(gè)空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C水浴中放置過(guò)久會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學(xué)移液管，慢慢向含有細(xì)胞的錐形管中加入10毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1。解凍培養(yǎng)基1應(yīng)滴加同時(shí)輕輕搖晃錐形管，以實(shí)現(xiàn)溫和混合并避免滲透休克。

4. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1中重懸細(xì)胞。

5. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

7. 細(xì)胞應(yīng)在完全融合前傳代。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1A。

細(xì)胞傳代

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1A并轉(zhuǎn)移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基1A中重懸細(xì)胞。

4. 按照推薦的次培養(yǎng)比例1:10至1:20，每周一次或兩次接種到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1A并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞至約2 x 10^6細(xì)胞/毫升。

數(shù)據(jù)展示：

圖1：全長(zhǎng)Notch1/CSL熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系中Notch1表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析。

全長(zhǎng)Notch1/CSL熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞（綠色）和CSL報(bào)告基因HEK293對(duì)照細(xì)胞（藍(lán)色）用PE偶聯(lián)的抗人Notch 1抗體（Biolegend #352106）染色，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。Y軸代表細(xì)胞數(shù)量百分比。X軸表示PE的強(qiáng)度。

文獻(xiàn)參考：

Lu F.M., et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(11): 5663-5667.

Kanungo J., et al., 2008 J. Neurochem. 106: 2236-48.

Cao L. et al., 2023 Blood Adv. 10.1182/bloodadvances.2023010380

Zhou B., et al., 2022 Nature 7:95

Benedito R., et al., 2009 Cell.12;137(6):1124-35.

BPS Bioscience是一家通過(guò)ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開(kāi)發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

作為BPS Bioscience在中國(guó)的區(qū)域代理，艾美捷科技有限公司將為中國(guó)客戶提供全面的BPS Bioscience以及客戶訂制化服務(wù)。