ADAR1活性雙熒光素酶報告基因HEK293細胞系是一種設計用來同時監(jiān)測細胞活力和ADAR1（作用于RNA的腺苷脫氨酶）酶活性的HEK293細胞系。這些細胞被改造以表達ADAR1（NM_001111.5）和一個ADAR1報告基因構(gòu)建體。該構(gòu)建體包含一個帶有終止密碼子（UAG）的ADAR1發(fā)夾靶標，該終止密碼子易受到ADAR1介導的編輯成色氨酸（UUG），位于熒光素酶報告基因的上游。此外，它們在CMV啟動子的控制下恒定表達Renilla熒光素酶，這可以用來確定細胞活力（圖1）。

該細胞系已通過ADAR1 siRNA處理和ADAR1抑制劑Fludarabine處理進行了驗證。

圖1：ADAR1活性雙熒光素酶報告基因HEK293細胞系的作用機制圖示。

ADAR1報告基因構(gòu)建體包含一個帶有終止密碼子（UAG）的ADAR1發(fā)夾靶標，位于編碼熒光素酶的序列上游。在沒有ADAR1的情況下，熒光素酶不會被轉(zhuǎn)錄，細胞不顯示熒光素酶活性。然而，這些細胞被改造以表達ADAR1，將腺嘌呤轉(zhuǎn)換成肌苷，現(xiàn)在編碼氨基酸色氨酸（UUG），使得熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和表達成為可能。因此，ADAR1活性與熒光素酶活性直接相關。Renilla熒光素酶從另一個獨立的構(gòu)建體中恒定表達，因此Renilla熒光素酶活性與細胞數(shù)量相關，但與ADAR1活性無關。

背景

ADAR（作用于RNA的腺苷脫氨酶）酶在RNA中執(zhí)行腺苷到肌苷的堿基編輯，特別針對位于特定雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的腺苷。在健康的未感染細胞中，ADAR1對內(nèi)源性雙鏈RNA進行A到I編輯以防止其激活下游的dsRNA傳感器RIG-I（視黃酸誘導基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相關蛋白5），進而激活促炎癥反應。ADAR1功能喪失突變導致dsRNA傳感器異常激活，并涉及自身免疫性疾病。ADAR1功能障礙也影響癌細胞生長、增殖和對免疫療法的反應。ADAR1在許多腫瘤類型中表達增加，ADAR1敲除已被證明可以改善對某些免疫療法的反應，如PD-1（程序性死亡蛋白1）/PD-L1（程序性死亡配體1）阻斷，并可繞過腫瘤免疫療法抵抗機制，使ADAR1成為治療開發(fā)的理想靶標。

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應用

? 監(jiān)測ADAR1活性。

? 研究化合物對ADAR1活性的影響。

? 同時測量化合物對ADAR1活性和細胞活力的影響。

細胞復蘇

1. 在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)冷凍細胞瓶大約60秒。細胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶內(nèi)的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升預熱的解凍培養(yǎng)基1的管中。

注意：在37°C水浴中放置細胞過久會導致細胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細胞準備好傳代。

5. 在細胞完全融合之前應進行傳代。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基1Y。

細胞傳代

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1Y并轉(zhuǎn)移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長培養(yǎng)基1Y中重懸細胞。

4. 按推薦的亞培養(yǎng)比例1:5至1:10每周一次或兩次播種到新的培養(yǎng)容器中。

細胞冷凍

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗滌細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1Y并計數(shù)細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C細胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細胞，濃度約為1 x 10^6細胞/毫升。

4. 將1毫升細胞懸浮液分裝到每個冷凍管中。將管放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜儲存。

5. 次日將管轉(zhuǎn)移到液氮中進行長期儲存。

注意：建議在早期傳代擴展細胞并至少冷凍10管細胞以備將來使用。

圖：ADAR1活性雙熒光素酶報告基因HEK293細胞系中ADAR1活性被ADAR1靶向siRNA抑制。

細胞被轉(zhuǎn)染ADAR1靶向siRNA 24小時。培養(yǎng)基被更換為新培養(yǎng)基，然后細胞再孵化48小時。使用雙步熒光素酶（熒光素酶&Renilla）檢測系統(tǒng)測量了熒光素酶和Renilla熒光素酶活性。結(jié)果以標準化發(fā)光（左圖）和百分比標準化發(fā)光（右圖）與未經(jīng)siRNA處理的細胞（設為100%）進行比較。

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