ADAR1活性熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系是一種設(shè)計(jì)用來監(jiān)測(cè)ADAR1（作用于RNA的腺苷脫氨酶）酶活性的HEK293細(xì)胞系。這些細(xì)胞被改造以過表達(dá)人類ADAR1（NM_001111.5）和一個(gè)ADAR1報(bào)告基因構(gòu)建體，包含一個(gè)帶有終止密碼子（UAG）的ADAR1發(fā)夾靶標(biāo)，該終止密碼子易受到ADAR1介導(dǎo)的編輯成色氨酸（UUG），位于熒光素酶報(bào)告基因的上游（圖1）。

該細(xì)胞系已通過與ADAR1反應(yīng)型熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系（#82238）的報(bào)告基因激活比較以及對(duì)ADAR1 siRNA處理的反應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖1：ADAR1活性熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系的作用機(jī)制圖示。

ADAR1報(bào)告基因構(gòu)建體由一個(gè)帶有終止密碼子（UAG）的ADAR1發(fā)夾靶標(biāo)組成，位于編碼熒光素酶的序列上游。在沒有ADAR1的情況下，熒光素酶不會(huì)被轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞不顯示熒光素酶活性。在ADAR1活性存在的情況下，腺嘌呤被轉(zhuǎn)換成肌苷，現(xiàn)在編碼氨基酸色氨酸（UUG），使得熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)成為可能。因此，ADAR1活性與熒光素酶活性直接相關(guān)。

背景

ADAR（作用于RNA的腺苷脫氨酶）酶在RNA中執(zhí)行腺苷到肌苷的堿基編輯，特別針對(duì)位于特定雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1）中的腺苷。在健康的未感染細(xì)胞中，ADAR1對(duì)內(nèi)源性雙鏈RNA進(jìn)行A到I編輯以防止其激活下游的dsRNA傳感器RIG-I（視黃酸誘導(dǎo)基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5），進(jìn)而激活促炎癥反應(yīng)。ADAR1功能喪失突變導(dǎo)致dsRNA傳感器異常激活，并涉及自身免疫性疾病。ADAR1功能障礙也影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和對(duì)免疫療法的反應(yīng)。ADAR1在許多腫瘤類型中表達(dá)增加，ADAR1敲除已被證明可以改善對(duì)某些免疫療法的反應(yīng)，如PD-1（程序性死亡蛋白1）/PD-L1（程序性死亡配體1）阻斷，并可繞過腫瘤免疫療法抵抗機(jī)制，使ADAR1成為治療開發(fā)的理想靶標(biāo)。

作為BPS Bioscience在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品ADAR1 活性熒光素酶報(bào)告基因 HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

? 監(jiān)測(cè)ADAR1活性。

? 研究化合物對(duì)ADAR1活性的影響。

細(xì)胞復(fù)蘇

1. 在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶?jī)?nèi)的全部?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1的管中。

注意：在37°C水浴中放置細(xì)胞過久會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 在細(xì)胞完全融合之前應(yīng)進(jìn)行傳代。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1U。

細(xì)胞傳代

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1U并轉(zhuǎn)移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基1U中重懸細(xì)胞。

4. 按推薦的亞培養(yǎng)比例1:5至1:10每周一次或兩次播種到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗滌細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1U并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞，濃度約為1 x 10^6細(xì)胞/毫升。

4. 將1毫升細(xì)胞懸浮液分裝到每個(gè)冷凍管中。將管放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜儲(chǔ)存。

5. 次日將管轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

注意：建議在早期傳代擴(kuò)展細(xì)胞并至少冷凍10管細(xì)胞以備將來使用。

圖2：ADAR1活性熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系中ADAR1蛋白表達(dá)的西方印跡分析。

使用重組抗ADAR1抗體[EPR7033]（Abcam #ab126745）或β-Actin（13E5）兔mAB（Cell Signaling Technology #4970）作為一抗，隨后使用二抗HRP標(biāo)記的抗體2（BPS Biosciences #52131H）對(duì)ADAR1活性熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞裂解物或親本ADAR1反應(yīng)型熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞裂解物進(jìn)行西方印跡分析。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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