維持基因組完整性對于細胞的正常功能至關重要。在人體中，超過150種蛋白質構成了一個復雜的DNA損傷響應（DDR）網絡，該網絡不斷掃描并修復DNA。多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）蛋白家族包含17個成員，它們催化蛋白質的ADP-核糖化。PARPs參與廣泛的生物學功能，包括DNA損傷修復、基因組穩(wěn)定性、染色質重塑、有絲分裂紡錘體組裝、RNA周轉和基因表達調控，以及DNA甲基化。盡管這些蛋白同屬一個家族，但它們表現出不同的特征。一些PARPs僅具有單ADP-核糖化活性（MARylation），而另一些PARPs則催化多ADP-核糖化（PARylation），這種反應可以以線性或分支形式發(fā)生。

PARPs可能主要定位于細胞核、細胞質或兩者兼有。它們在大小和結構上差異顯著，并且包含多種功能域。值得注意的是，PARP5A和PARP5B除了催化域外，僅含有一個大的ankyrin結構域（因此被稱為tankyrase，分別對應PARP5A的TNKS1和PARP5B的TNKS2）。其他顯著特征包括PARP1、PARP2和PARP3對DNA的嚴格依賴性，以及每種酶對底物的特異性。

與許多具有關鍵作用的蛋白質家族一樣，PARP蛋白在功能上存在重疊。PARP1和PARP2主要參與DNA修復，并且這兩種蛋白都調控DNA損傷響應（DDR）網絡。PARP2還調節(jié)表觀遺傳、增殖和炎癥過程，并對精原細胞、胸腺和脂肪組織的發(fā)育至關重要。相比之下，當DNA損傷無法修復時，PARP1會改變轉錄并誘導細胞凋亡。PARP1是受損DNA的第一響應者，其重要性體現在其豐富的含量上，因為它是最常見的核蛋白之一。

DDR通路的缺陷會導致基因組不穩(wěn)定和突變的積累，這些突變支持腫瘤細胞的出現和進化。因此，BRCA1或BRCA2（乳腺癌易感蛋白1/2）的突變會損害細胞通過同源重組（HR）修復雙鏈DNA斷裂的能力，從而增加個體患乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌的風險。然而，HR依賴性DNA修復系統(tǒng)的缺失意味著這些腫瘤細胞依賴其他修復通路來生存，這暴露了它們的治療薄弱點。

事實上，對PARPs作為治療靶點的興趣最初源于發(fā)現PARP1/2抑制劑能夠殺死攜帶BRCA1或BRCA2突變的癌細胞。這一觀察首次證明了合成致死的概念，即同時破壞兩種蛋白質會導致細胞死亡，而單獨破壞其中一種則不會影響細胞活性。

目前，已有幾種PARP抑制劑獲得臨床使用批準，還有許多其他抑制劑正在通過（臨床前）臨床階段。隨著研究證實阻斷任何HR通路（不限于BRCA基因）都會賦予腫瘤細胞“BRCA樣”特征，其應用范圍也在不斷擴大。改進現有的抑制劑、靶向其他PARP家族成員以及開發(fā)能夠克服治療耐藥性的新抑制劑，仍然是癌癥藥物開發(fā)的重中之重。

BPS Bioscience專業(yè)生產生物活性酶、蛋白質復合物、酶活分析試劑盒以及抑制劑曬先試劑盒，可以提供多種PARPs蛋白和檢測試劑盒：

1. PARPs蛋白：

2.1 PARPs活性檢測，用于篩選抑制劑 

ADP-核糖化是一種可逆的反應，通過NAD?作為核糖供體，將ADP-核糖單元添加到蛋白質底物中存在的谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）或賴氨酸（Lys）殘基的羧基上。在體外檢測PARP活性時，需要使用PARP底物、NAD?、用于DNA依賴性PARP1-3的DNA探針以及純化的PARP酶。所有這些組分都必須經過精心優(yōu)化，以確保實驗的靈敏度、穩(wěn)健性和可重復性。

2.1.1 基于ELISA法檢測

基于酶聯免疫吸附測定（ELISA）的化學發(fā)光和比色試劑盒旨在用于藥物分析應用中檢測PARP活性。在這些實驗中，蛋白底物被包被在板上。接下來，在優(yōu)化的實驗緩沖液中加入生物素標記的NAD?混合物和純化的PARP酶。然后加入鏈霉親和素-HRP（辣根過氧化物酶），隨后加入適當的HRP底物以產生化學發(fā)光或顏色變化。每一步驟后都會對板進行洗滌。信號強度與結合到組蛋白上的生物素-NAD?的量成正比。

2.1.2 基于AlphaLISA法檢測 

AlphaLISA是一種由PerkinElmer開發(fā)的基于微珠的無洗滌技術，能夠定量檢測蛋白質-蛋白質結合或新的酶促產物。AlphaLISA PARP均相檢測試劑盒利用了一種高度特異性的抗體，能夠識別PARylated（聚腺苷二磷酸核糖基化）底物。因此，它們可以測量特定PARP家族成員的酶活性。檢測的特異性與純化蛋白的身份密切相關。檢測流程非常簡單：首先，將酶與生物素標記的底物進行孵育。接著，加入受體微珠和一抗，然后加入供體微珠。這些無洗滌步驟之后，直接讀取Alpha計數。需要注意的是，這些檢測需要配備專門的AlphaScreen微孔板讀取儀。這種檢測設計以其快速完成時間和高度適用于高通量應用而非常有效，例如用于篩選小分子庫以發(fā)現新的PARP抑制劑。其他應用還包括準確測量化合物的EC50值。

2.2 篩選將PARP固定在DNA上的化合物 

當PARP1和PARP2結合受損的DNA時，它們會將PAR鏈添加到自身的蛋白骨架上（自聚腺苷二磷酸核糖基化，auto-PARylation），隨后再添加到其他DNA損傷應答（DDR）蛋白上，以招募并激活它們。隨后，PARylated的PARP1和PARP2從DNA上脫離，以便其他PARylated的修復伙伴能夠啟動修復過程。一些已獲批的藥物通過與NAD?競爭結合催化位點來抑制PARP1和PARP2的活性。沒有NAD?時，PARP無法進行PARylation，且持續(xù)結合在受損的DNA上，阻止其他DDR蛋白接近DNA。這會阻礙DNA修復，增加細胞毒性，從而增強這些藥物的作用。因此，這類藥物的細胞毒性主要取決于它們將蛋白固定在受損DNA上的效率，盡管科學家最近發(fā)現，與PARP2不同，將PARP1通過PARP抑制劑固定在DNA上會增加細胞毒性。因此，篩選這些藥物時應包括能夠定量檢測PARP固定能力的檢測，并區(qū)分抑制劑對PARP1或PARP2的選擇性。

大多數商業(yè)化的PARP活性檢測方法僅定量檢測目標蛋白（如組蛋白）的PARylation，并且一次只檢測一種PARP酶。相比之下，BPS Bioscience的cat#78317能夠在同一檢測中比較一種分子固定PARP1與PARP2的能力。該檢測使用熒光標記的DNA探針，這些探針根據PARP1或PARP2的結合發(fā)出偏振光。當PARP1或PARP2結合到DNA時，這些探針具有高熒光偏振（FP）。當科學家在檢測中加入NAD?時，PARylated的酶會從探針上脫離，降低FP水平。如果他們加入NAD?和PARP抑制劑，抑制劑的固定能力會以劑量依賴的方式增加FP。

2.3 優(yōu)化針對PARP1的PROTACs  (蛋白水解靶向嵌合分子) 

蛋白水解靶向嵌合分子（Proteolysis Targeting Chimeras，簡稱PROTACs）通過將目標蛋白靶向到泛素E3連接酶，促進蛋白酶體介導的蛋白質降解。通過PROTAC誘導的PARP降解可能是從靶細胞中消除該蛋白的替代策略。一個PROTAC分子由一個結合E3連接酶的配體組成，通過一個連接子與結合目標蛋白的配體相連。這種新技術與傳統(tǒng)的小分子介導的蛋白質活性抑制相比具有獨特的優(yōu)勢。例如，一個單一的PROTAC可以促進多種蛋白質的降解，因為在其靶標的降解后它可以被回收利用。它已被證明特別適用于“難以成藥”的蛋白質，因為至少在理論上，任何目標蛋白都可以使用這種技術進行靶向。然而，PROTAC的開發(fā)需要經過幾個優(yōu)化步驟，這些步驟因蛋白質降解量化的技術難度而受到阻礙。PROTAC優(yōu)化檢測通過直接測量PROTAC介導的復合物形成來繞過這些困難。

2.4 篩選與Olaparib在PARP相同結合位點的化合物

PARP與含有olaparib的熒光探針結合，形成復合物。當受到偏振光激發(fā)時，該復合物由于其在溶液中的運動受限而發(fā)出高度偏振光（FP）。在測試化合物存在的情況下，PARP可能與測試化合物（如果該化合物與Olaparib具有相同的PARP結合位點）或與含有Olaparib的熒光探針形成復合物。如果測試化合物與PARP在同一位點結合，則含有olaparib的熒光探針留在溶液中并自由旋轉，這表現為低FP。FP值的下降與測試化合物與PARP的競爭性結合成正比。