維持基因組完整性對于細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。在人體中，超過150種蛋白質(zhì)構(gòu)成了一個復(fù)雜的DNA損傷響應(yīng)（DDR）網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)不斷掃描并修復(fù)DNA。多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）蛋白家族包含17個成員，它們催化蛋白質(zhì)的ADP-核糖化。PARPs參與廣泛的生物學(xué)功能，包括DNA損傷修復(fù)、基因組穩(wěn)定性、染色質(zhì)重塑、有絲分裂紡錘體組裝、RNA周轉(zhuǎn)和基因表達調(diào)控，以及DNA甲基化。盡管這些蛋白同屬一個家族，但它們表現(xiàn)出不同的特征。一些PARPs僅具有單ADP-核糖化活性（MARylation），而另一些PARPs則催化多ADP-核糖化（PARylation），這種反應(yīng)可以以線性或分支形式發(fā)生。

PARPs可能主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或兩者兼有。它們在大小和結(jié)構(gòu)上差異顯著，并且包含多種功能域。值得注意的是，PARP5A和PARP5B除了催化域外，僅含有一個大的ankyrin結(jié)構(gòu)域（因此被稱為tankyrase，分別對應(yīng)PARP5A的TNKS1和PARP5B的TNKS2）。其他顯著特征包括PARP1、PARP2和PARP3對DNA的嚴(yán)格依賴性，以及每種酶對底物的特異性。

與許多具有關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)家族一樣，PARP蛋白在功能上存在重疊。PARP1和PARP2主要參與DNA修復(fù)，并且這兩種蛋白都調(diào)控DNA損傷響應(yīng)（DDR）網(wǎng)絡(luò)。PARP2還調(diào)節(jié)表觀遺傳、增殖和炎癥過程，并對精原細(xì)胞、胸腺和脂肪組織的發(fā)育至關(guān)重要。相比之下，當(dāng)DNA損傷無法修復(fù)時，PARP1會改變轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PARP1是受損DNA的第一響應(yīng)者，其重要性體現(xiàn)在其豐富的含量上，因為它是最常見的核蛋白之一。

DDR通路的缺陷會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和突變的積累，這些突變支持腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)和進化。因此，BRCA1或BRCA2（乳腺癌易感蛋白1/2）的突變會損害細(xì)胞通過同源重組（HR）修復(fù)雙鏈DNA斷裂的能力，從而增加個體患乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌的風(fēng)險。然而，HR依賴性DNA修復(fù)系統(tǒng)的缺失意味著這些腫瘤細(xì)胞依賴其他修復(fù)通路來生存，這暴露了它們的治療薄弱點。

事實上，對PARPs作為治療靶點的興趣最初源于發(fā)現(xiàn)PARP1/2抑制劑能夠殺死攜帶BRCA1或BRCA2突變的癌細(xì)胞。這一觀察首次證明了合成致死的概念，即同時破壞兩種蛋白質(zhì)會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而單獨破壞其中一種則不會影響細(xì)胞活性。

目前，已有幾種PARP抑制劑獲得臨床使用批準(zhǔn)，還有許多其他抑制劑正在通過（臨床前）臨床階段。隨著研究證實阻斷任何HR通路（不限于BRCA基因）都會賦予腫瘤細(xì)胞“BRCA樣”特征，其應(yīng)用范圍也在不斷擴大。改進現(xiàn)有的抑制劑、靶向其他PARP家族成員以及開發(fā)能夠克服治療耐藥性的新抑制劑，仍然是癌癥藥物開發(fā)的重中之重。

BPS Bioscience專業(yè)生產(chǎn)生物活性酶、蛋白質(zhì)復(fù)合物、酶活分析試劑盒以及抑制劑曬先試劑盒，可以提供多種PARPs蛋白和檢測試劑盒：

1. PARPs蛋白：

2.1 PARPs活性檢測，用于篩選抑制劑 

ADP-核糖化是一種可逆的反應(yīng)，通過NAD?作為核糖供體，將ADP-核糖單元添加到蛋白質(zhì)底物中存在的谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）或賴氨酸（Lys）殘基的羧基上。在體外檢測PARP活性時，需要使用PARP底物、NAD?、用于DNA依賴性PARP1-3的DNA探針以及純化的PARP酶。所有這些組分都必須經(jīng)過精心優(yōu)化，以確保實驗的靈敏度、穩(wěn)健性和可重復(fù)性。

2.1.1 基于ELISA法檢測

基于酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）的化學(xué)發(fā)光和比色試劑盒旨在用于藥物分析應(yīng)用中檢測PARP活性。在這些實驗中，蛋白底物被包被在板上。接下來，在優(yōu)化的實驗緩沖液中加入生物素標(biāo)記的NAD?混合物和純化的PARP酶。然后加入鏈霉親和素-HRP（辣根過氧化物酶），隨后加入適當(dāng)?shù)腍RP底物以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或顏色變化。每一步驟后都會對板進行洗滌。信號強度與結(jié)合到組蛋白上的生物素-NAD?的量成正比。

2.1.2 基于AlphaLISA法檢測 

AlphaLISA是一種由PerkinElmer開發(fā)的基于微珠的無洗滌技術(shù)，能夠定量檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合或新的酶促產(chǎn)物。AlphaLISA PARP均相檢測試劑盒利用了一種高度特異性的抗體，能夠識別PARylated（聚腺苷二磷酸核糖基化）底物。因此，它們可以測量特定PARP家族成員的酶活性。檢測的特異性與純化蛋白的身份密切相關(guān)。檢測流程非常簡單：首先，將酶與生物素標(biāo)記的底物進行孵育。接著，加入受體微珠和一抗，然后加入供體微珠。這些無洗滌步驟之后，直接讀取Alpha計數(shù)。需要注意的是，這些檢測需要配備專門的AlphaScreen微孔板讀取儀。這種檢測設(shè)計以其快速完成時間和高度適用于高通量應(yīng)用而非常有效，例如用于篩選小分子庫以發(fā)現(xiàn)新的PARP抑制劑。其他應(yīng)用還包括準(zhǔn)確測量化合物的EC50值。

2.2 篩選將PARP固定在DNA上的化合物 

當(dāng)PARP1和PARP2結(jié)合受損的DNA時，它們會將PAR鏈添加到自身的蛋白骨架上（自聚腺苷二磷酸核糖基化，auto-PARylation），隨后再添加到其他DNA損傷應(yīng)答（DDR）蛋白上，以招募并激活它們。隨后，PARylated的PARP1和PARP2從DNA上脫離，以便其他PARylated的修復(fù)伙伴能夠啟動修復(fù)過程。一些已獲批的藥物通過與NAD?競爭結(jié)合催化位點來抑制PARP1和PARP2的活性。沒有NAD?時，PARP無法進行PARylation，且持續(xù)結(jié)合在受損的DNA上，阻止其他DDR蛋白接近DNA。這會阻礙DNA修復(fù)，增加細(xì)胞毒性，從而增強這些藥物的作用。因此，這類藥物的細(xì)胞毒性主要取決于它們將蛋白固定在受損DNA上的效率，盡管科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)，與PARP2不同，將PARP1通過PARP抑制劑固定在DNA上會增加細(xì)胞毒性。因此，篩選這些藥物時應(yīng)包括能夠定量檢測PARP固定能力的檢測，并區(qū)分抑制劑對PARP1或PARP2的選擇性。

大多數(shù)商業(yè)化的PARP活性檢測方法僅定量檢測目標(biāo)蛋白（如組蛋白）的PARylation，并且一次只檢測一種PARP酶。相比之下，BPS Bioscience的cat#78317能夠在同一檢測中比較一種分子固定PARP1與PARP2的能力。該檢測使用熒光標(biāo)記的DNA探針，這些探針根據(jù)PARP1或PARP2的結(jié)合發(fā)出偏振光。當(dāng)PARP1或PARP2結(jié)合到DNA時，這些探針具有高熒光偏振（FP）。當(dāng)科學(xué)家在檢測中加入NAD?時，PARylated的酶會從探針上脫離，降低FP水平。如果他們加入NAD?和PARP抑制劑，抑制劑的固定能力會以劑量依賴的方式增加FP。

2.3 優(yōu)化針對PARP1的PROTACs  (蛋白水解靶向嵌合分子) 

蛋白水解靶向嵌合分子（Proteolysis Targeting Chimeras，簡稱PROTACs）通過將目標(biāo)蛋白靶向到泛素E3連接酶，促進蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解。通過PROTAC誘導(dǎo)的PARP降解可能是從靶細(xì)胞中消除該蛋白的替代策略。一個PROTAC分子由一個結(jié)合E3連接酶的配體組成，通過一個連接子與結(jié)合目標(biāo)蛋白的配體相連。這種新技術(shù)與傳統(tǒng)的小分子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)活性抑制相比具有獨特的優(yōu)勢。例如，一個單一的PROTAC可以促進多種蛋白質(zhì)的降解，因為在其靶標(biāo)的降解后它可以被回收利用。它已被證明特別適用于“難以成藥”的蛋白質(zhì)，因為至少在理論上，任何目標(biāo)蛋白都可以使用這種技術(shù)進行靶向。然而，PROTAC的開發(fā)需要經(jīng)過幾個優(yōu)化步驟，這些步驟因蛋白質(zhì)降解量化的技術(shù)難度而受到阻礙。PROTAC優(yōu)化檢測通過直接測量PROTAC介導(dǎo)的復(fù)合物形成來繞過這些困難。

2.4 篩選與Olaparib在PARP相同結(jié)合位點的化合物

PARP與含有olaparib的熒光探針結(jié)合，形成復(fù)合物。當(dāng)受到偏振光激發(fā)時，該復(fù)合物由于其在溶液中的運動受限而發(fā)出高度偏振光（FP）。在測試化合物存在的情況下，PARP可能與測試化合物（如果該化合物與Olaparib具有相同的PARP結(jié)合位點）或與含有Olaparib的熒光探針形成復(fù)合物。如果測試化合物與PARP在同一位點結(jié)合，則含有olaparib的熒光探針留在溶液中并自由旋轉(zhuǎn)，這表現(xiàn)為低FP。FP值的下降與測試化合物與PARP的競爭性結(jié)合成正比。