G-switch?系列小G蛋白工具系列的開(kāi)發(fā)側(cè)重于創(chuàng)建針對(duì)內(nèi)源性Rho家族蛋白和信號(hào)通路的高效試劑。與依賴(lài)于過(guò)表達(dá)或敲降目標(biāo)蛋白的方法（例如，DNA轉(zhuǎn)染顯性負(fù)性或常活性Rho突變體，RNAi敲降）相比，G-switch?試劑能夠迅速作用于內(nèi)源性目標(biāo)蛋白（根據(jù)產(chǎn)品而定，時(shí)間范圍為分鐘至小時(shí)），從而優(yōu)化產(chǎn)生更具生理學(xué)相關(guān)性的反應(yīng)的機(jī)會(huì)。G-switch?產(chǎn)品系列包括直接和間接調(diào)節(jié)Rho家族信號(hào)傳導(dǎo)的試劑，因此提供了廣泛的機(jī)制工具來(lái)研究這些關(guān)鍵的細(xì)胞功能。請(qǐng)?jiān)L問(wèn)Cytoskeleton公司的網(wǎng)站獲取最新的G-switch?信息。

CN03的活性位點(diǎn)基于細(xì)菌細(xì)胞毒性壞死因子（CNF）毒素的催化結(jié)構(gòu)域。催化結(jié)構(gòu)域與一種專(zhuān)有的細(xì)胞穿透基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。CN03通過(guò)脫氨酰胺化位于這些GTP酶的Switch II區(qū)域的谷氨酰胺-63來(lái)激活Rho GTP酶亞型（1）。這種修飾將谷氨酰胺-63轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔瑥亩钄嗔斯逃泻虶AP刺激的GTP酶活性，導(dǎo)致Rho的常活性（2）。在添加到培養(yǎng)基后的2-4小時(shí)內(nèi)，CN03顯著增加了GTP結(jié)合的RhoA水平。此外，這種激活劑的有針對(duì)性作用使其比經(jīng)典的間接激活劑（例如，LPA）更具吸引力，后者同時(shí)激活其他信號(hào)通路（例如，Ras、PI3K和PLC）。

艾美捷Rho 激活劑 II（#CN03）用途包括：

Rho通路激活劑

研究Rho活化對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響

研究Rho活化對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排的影響

研究 Rho 激活對(duì)與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路串?dāng)_的影響

材料：

CN03是在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中制備的。重組蛋白的分子量為118 kDa，并在其氨基端含有六個(gè)組氨酸殘基（His標(biāo)簽）。經(jīng)過(guò)固定金屬親和層析（圖1），已經(jīng)純化至80%以上的純度。每個(gè)小瓶中提供的是白色凍干固體，含有20 ?g的CN03蛋白。該物質(zhì)已經(jīng)在RhoA激活的生物學(xué)檢測(cè)中顯示出活性（見(jiàn)下文）。在RhoA激活的生物學(xué)檢測(cè)中，一個(gè)包含單點(diǎn)突變的蛋白質(zhì)失活突變體顯示出零活性（未顯示數(shù)據(jù)）。

儲(chǔ)存和重溶：

在常溫下運(yùn)輸。凍干的蛋白質(zhì)可以在4°C下干燥儲(chǔ)存6個(gè)月。CN03的凍干顆粒可能看起來(lái)松散且輕包裝，但這不會(huì)影響CN03的質(zhì)量或性能。為了重溶，簡(jiǎn)單離心以收集管底的產(chǎn)物，然后將每個(gè)小瓶中的產(chǎn)物重懸于200 ?l無(wú)菌水中，放在冰上靜置10分鐘，輕輕上下吸移混勻，得到0.1 ?g/?l的濃度。在使用之前，CN03應(yīng)進(jìn)一步與無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至0.25至5 ?g/ml的濃度（由用戶(hù)確定，參見(jiàn)圖2和表1）。通常，在3小時(shí)內(nèi)，1 ?g/ml的濃度能夠在多種細(xì)胞類(lèi)型中產(chǎn)生強(qiáng)大的RhoA激活。重溶的激活劑可以在液氮中快速冷凍，并在–70°C下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。

Rho 激活劑 II生物活性檢測(cè)：

在37°C孵育2小時(shí)后，CN03（1 ?g/ml / 相當(dāng)于10 ?l/ml）顯示出在瑞士3T3細(xì)胞中引發(fā)了十倍的RhoA激活（圖2和圖3）和應(yīng)力纖維誘導(dǎo)（圖4）。在表1中詳細(xì)介紹了在幾種細(xì)胞類(lèi)型中激活Rho的推薦條件。

活性檢測(cè)方法：瑞士3T3細(xì)胞激活

1. 在兩個(gè)含有10 ml DMEM / 10%胎牛血清（FBS）的10 cm?培養(yǎng)皿中，將瑞士3T3細(xì)胞以37°C / 5% CO2培養(yǎng)至30%的密度。

2. 將培養(yǎng)基更換為DMEM / 1% FBS，饑餓細(xì)胞24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到DMEM / 0% FBS培養(yǎng)24小時(shí)。

3. 簡(jiǎn)要離心CN03管，使其沉淀在管底。

4. 用200 ?l無(wú)菌水（0.1 ?g/?l）重溶CN03-請(qǐng)參見(jiàn)上面的儲(chǔ)存和重溶部分。

5. 用溫暖的DMEM將CN03稀釋至1 ?g/ml。

6. 吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，將含有CN03的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個(gè)培養(yǎng)皿中。

7. 只向第二個(gè)培養(yǎng)皿中加入溫暖的DMEM。這是對(duì)照組，代表未刺激的細(xì)胞。

8. 在37°C和5% CO2下孵育2小時(shí)。通過(guò)G-LISA?分析（Cat. # BK124；圖2和圖3）或細(xì)胞形態(tài)學(xué)（Cat. # PHDG1；圖4）來(lái)檢測(cè)Rho活性。

Rho 激活劑 II文獻(xiàn)參考： 

1. Schmidt G., et al. 1997. Gln 63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature. 387, 725-729.

2. Flatau G., et al. 1997. Toxin-induced activation of the G protein p21 Rho by deamidation of glutamine. Nature. 387, 729-733.

Cytoskeleton公司成立于1993年，專(zhuān)注于生物化學(xué)和細(xì)胞過(guò)程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)。公司提供藥物篩選、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM）、細(xì)胞骨架研究相關(guān)的系列試劑盒和產(chǎn)品，尤其以細(xì)胞骨架相關(guān)研究見(jiàn)長(zhǎng)，既能滿(mǎn)足于樣品較少的科學(xué)研究，也可以用于小規(guī)模篩選研究和高通量大規(guī)模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動(dòng)蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現(xiàn)有產(chǎn)品的藥物篩選服務(wù)。