一、產(chǎn)品概述

CN03 是 G-Switch 系列產(chǎn)品中的核心成員，來源于細(xì)菌 CNF 毒素的催化結(jié)構(gòu)域，并通過專有技術(shù)連接了細(xì)胞穿透性基團(tuán)。該重組蛋白能夠快速、特異、不可逆地激活活細(xì)胞中的 RhoA、RhoB 和 RhoC 蛋白，為研究 Rho 介導(dǎo)的細(xì)胞事件提供了強(qiáng)大的正向調(diào)控工具。

CN03 在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)，為帶有 His 標(biāo)簽的重組蛋白，分子量約為 118 kDa。每管提供 20 ug 凍干粉。該產(chǎn)品由Cytoskeleton研發(fā)，艾美捷代理。

二、核心應(yīng)用場景

活細(xì)胞中 Rho 蛋白的直接激活：無需上游信號分子或激動劑，直接作用于 Rho 蛋白本身。

Rho 激活實驗的陽性對照：在進(jìn)行 RNA 干擾、抑制劑篩選或基因敲除實驗時，作為驗證通路活性的可靠參照。

研究 Rho 介導(dǎo)事件的潛在機(jī)制：探究細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移、黏附、增殖、分化等過程中 Rho 信號通路的上下游關(guān)系。

三、作用機(jī)制

CN03 通過催化 Switch II 區(qū)域第 63 位谷氨酰胺（Gln-63）的脫酰胺化，將其轉(zhuǎn)化為谷氨酸，從而阻斷 Rho GTPases 的內(nèi)源性 GTP 水解活性。這一修飾導(dǎo)致 Rho 蛋白持續(xù)處于 GTP 結(jié)合狀態(tài)，實現(xiàn)組成型激活。與傳統(tǒng)的鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）不同，CN03 不依賴于核苷酸交換，而是直接破壞 GTP 酶活性中心，因此激活效果為不可逆。

該機(jī)制對 RhoA、RhoB 和 RhoC 具有高度選擇性，對其他 Rho 家族成員（如 Rac 或 Cdc42）無明顯交叉激活作用。

四、產(chǎn)品關(guān)鍵特性匯總

特性 | 描述

分子量 | 118 kDa（含 His 標(biāo)簽）

來源 | 細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)

純度 | >80%（考馬斯亮藍(lán)染色掃描密度法）

規(guī)格 | 20 ug/管，凍干粉

推薦工作濃度 | 1 ug/ml

激活時效 | 1–4 小時達(dá)到峰值

激活持續(xù)時間 | 不可逆，≥4 小時

典型激活倍數(shù) | 10–15 倍

五、制備與使用方法

重構(gòu)步驟

1. 每管凍干粉中加入 200 ul 無菌水。

2. 輕輕混勻至完全溶解，得到濃度為 0.1 mg/ml 的儲備液。

3. 根據(jù)實驗需要，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至工作濃度（推薦 1 ug/ml）。

用量計算

每管（20 ug）重構(gòu)后可得 200 ul 儲備液（0.1 mg/ml）。

按 1 ug/ml 工作濃度計算，每管足夠配制 20 ml 工作液。

操作建議

將 CN03 直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，無需轉(zhuǎn)染或顯微注射。

激活時間因細(xì)胞系而異，通常在 1–4 小時內(nèi)達(dá)到最大激活水平。

由于激活不可逆，長時間實驗（≥4 小時）無需補(bǔ)加試劑。

純度分析

CN03 的純度通過 4–20% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，再使用掃描密度法進(jìn)行評估。測定結(jié)果顯示純度 >80%。盡管并非絕對純品，但該純度已足以滿足絕大多數(shù)活細(xì)胞功能實驗的要求，且剩余組分不影響其生物活性。

生物活性測定

驗證方法

CN03 的生物活性通過其在活 Swiss 3T3 細(xì)胞中激活 RhoA 的能力進(jìn)行驗證。使用 RhoA G-LISA 檢測試劑盒（BK124） 定量測定活化水平。

活性數(shù)據(jù)

以 1 ug/ml 處理細(xì)胞，1–2 小時內(nèi)可產(chǎn)生約 10 倍的 RhoA 激活。

包含單點(diǎn)失活突變（催化結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵氨基酸替換）的突變蛋白在相同檢測中顯示零活性，證明 CN03 的激活作用完全依賴于其酶催化活性。

細(xì)胞系依賴性

不同細(xì)胞系對 CN03 的響應(yīng)存在差異。建議在實驗前對特定細(xì)胞系進(jìn)行時間梯度（1、2、4、6 小時）和濃度梯度（0.1、0.5、1、2 ug/ml）的預(yù)實驗，以確定最佳處理條件。

典型激活時間曲線

1 小時：可檢測到顯著激活（約 5–6 倍）

2 小時：達(dá)到約 10 倍激活

4 小時：達(dá)到峰值（10–15 倍），并維持至至少 4 小時

六、實驗注意事項

1. 不可逆性：CN03 激活的 Rho 無法通過洗滌或添加抑制劑逆轉(zhuǎn)，因此不適用于需要“關(guān)閉”信號的時間分辨實驗。

2. 細(xì)胞類型差異：原代細(xì)胞或某些懸浮細(xì)胞可能需要更高的濃度（最高 2 ug/ml）或更長的孵育時間（4–6 小時）。

3. 對照設(shè)置：建議同時設(shè)置未處理對照和熱滅活（95°C 10 分鐘）CN03 對照，以排除非特異性效應(yīng)。

4. 儲存：凍干粉儲存于 -20°C，干燥避光。重構(gòu)后建議在 4°C 下 1 周內(nèi)使用，或分裝凍存于 -80°C（避免反復(fù)凍融）。