補體系統(tǒng)在自身免疫和感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。補體激活有三條途徑：經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑。C4d蛋白是經(jīng)典途徑和凝集素途徑的產(chǎn)物。

C4d是補體C4激活過程中產(chǎn)生的降解終產(chǎn)物，在1990年代被認定為一種生物標(biāo)志物，因為它的穩(wěn)定性和與抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的強關(guān)聯(lián)。在過去的二十年中，C4d在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）中的潛在重要性被強調(diào)，作為診斷和監(jiān)測SLE的工具（1）。特別是，C4d與SLE腎炎相關(guān)（2）。在原發(fā)性干燥綜合癥（pSS）中，C4d水平與抗-SSB抗體和κ/λ比率相關(guān)，建議其作為pSS患者中抗體反應(yīng)和補體激活的適當(dāng)標(biāo)志物（3,4）。研究表明，抗體相關(guān)性血管炎患者的C4d血漿水平顯著高于狼瘡腎炎患者和正常對照組（5）。腎小管周圍的C4d沉積是長期移植物存活率的重要預(yù)測因子，并具有預(yù)后意義（6）。C4d在肺癌患者的生物樣本中增加，并與早期肺癌的不良預(yù)后相關(guān)（7,8）。C4d越來越被認為是一個潛在的生物標(biāo)志物，能夠指示抗體可能導(dǎo)致的組織損傷，例如系統(tǒng)性自身免疫疾病。C4d有潛力檢測處于抗體介導(dǎo)疾病后果風(fēng)險中的患者。此外，開發(fā)新的阻斷補體激活的治療藥物使得C4d成為一個標(biāo)志物，有可能識別和監(jiān)測可能從這些藥物中受益的患者（9）。基于線性新表位的補體檢測已被報道相較于構(gòu)象表位具有優(yōu)勢，因為它降低了假陽性的風(fēng)險并提高了特異性（10）。該補體檢測基于在激活后C4的切割位點暴露的短線性C4d新表位的檢測。

艾美捷補體C4d檢測試劑盒（Complement C4d）（#COMPLC4dRUO）的測定原理：

該裝置為一種比色法夾心ELISA。樣本在檢測稀釋液中稀釋，100?L稀釋樣本被轉(zhuǎn)移到微孔板中，并在室溫下孵育60分鐘。在第一次孵育期間，樣本中的C4d被預(yù)涂在微孔板表面的抗C4d-Neo單克隆抗體捕獲。洗滌以去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入第二種辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的單克隆抗體，該抗體能夠結(jié)合C4d的兩個等位變體（A和B）。經(jīng)過30分鐘的孵育后，再次洗滌孔，并添加底物進行孵育。30分鐘后停止顏色發(fā)展，并在分光光度計中測量顏色。顏色的深淺與結(jié)合到孔中的C4d量成正比。C4d的量通過與校準(zhǔn)樣本的顏色發(fā)展進行比較來確定。

標(biāo)本收集：

應(yīng)使用無菌靜脈穿刺技術(shù)收集血樣，并使用標(biāo)準(zhǔn)程序獲得EDTA血漿。建議每個樣本至少抽取5毫升全血。離心血樣并將無細胞血漿轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。必須妥善處理血漿，以防止體外補體激活。

離心后的EDTA血漿可在4°C下保存最多8小時，分析應(yīng)在此時間范圍內(nèi)進行。對于較長時間的儲存，血漿應(yīng)冷凍在-70°C或更低溫度。樣本不應(yīng)凍融超過兩次。

補體C4d檢測試劑盒成分及試劑儲存：

一個帶有微孔（12x8）的框架，涂有抗C4d-Neo單克隆抗體，用鋁箔包裝并附有干燥劑包。

1.5毫升低對照（LC）。即用型。

1.5毫升高對照（HC）。即用型。

2x30毫升稀釋液（Dil），紅色。即用型。

15毫升含有HRP標(biāo)記抗體的結(jié)合物，針對C4d。即用型。

15毫升底物TMB。即用型。

15毫升終止液（0.5M H2SO4）。即用型。

30毫升洗滌液，30倍濃縮。

6 x 1.5毫升的校準(zhǔn)劑量，含有人重組C4d，濃度為0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和400 ng/mL。即用型。

結(jié)果計算：

從450納米波長中減去620納米參考波長，并計算所有樣本的平均吸光度值。通過繪制校準(zhǔn)樣本的吸光度與濃度構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。六種校準(zhǔn)樣本的濃度為0 ng/ml、5 ng/ml、25 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和400 ng/ml。在本說明書的示例中使用了4參數(shù)曲線擬合（圖1）。用戶可以選擇不同的曲線擬合。根據(jù)校準(zhǔn)曲線讀取未知樣本的濃度。

注意：要計算血漿樣本中C4d的濃度，必須進行稀釋補償，即根據(jù)上述協(xié)議進行50倍的補償。如果選擇了不同的樣本稀釋，應(yīng)相應(yīng)地進行補償。

圖1. 校準(zhǔn)曲線示例

請注意：上圖顯示的是半定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的示例，不應(yīng)用于實際樣本的解釋。

補體C4d檢測試劑盒文獻參考：

1. Juan Li, Zhuoli Zhang, The Important Roles of C4d in Systemic Lupus Erythematosus,

Rheumatology (Sunnyvale) 2014, 4: 135. 4:2

2. Martin M, Smol?g KI, Bj?rk A, Gullstrand B, Okrój M, Leffler J, J?nsen A, Bengtsson AA,

Blom AM, Plasma C4d as marker for lupus nephritis in systemic lupus erythematosus.

Arthritis Res Ther. 2017 Dec 6;19(1):266. doi: 10.1186/s13075-017-1470-2.

3. Sudzius, G., et.al, 2014. Could the complement component C4 or its fragment C4d be a

marker of the more severe conditions in patients with primary Sjogren’ssyndrome?

Rheumatol. Int. 34, 235–241