鬼筆環(huán)肽是一種來自毒鵝膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能夠特異性且高親和力（解離常數(shù) Kd 為 20 nM）地結(jié)合到聚合態(tài)肌動(dòng)蛋白（F-肌動(dòng)蛋白）上。鬼筆環(huán)肽可將肌動(dòng)蛋白聚合的臨界濃度降低至不到 1 ?g/ml，從而作為一種聚合增強(qiáng)劑。鬼筆環(huán)肽已被標(biāo)記上一種專有的紅色熒光染料（1），使其可用于染色組織培養(yǎng)細(xì)胞和組織切片（2，見圖 2）以及無細(xì)胞體系中的肌動(dòng)蛋白絲。Acti-stain? 555 鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲保留了許多未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白的功能特性，包括它們與肌球蛋白相互作用的能力。

艾美捷Acti-stain555鬼筆環(huán)肽（#PHDH1-A）以紅色固體形式提供，分子量為 1775。對(duì)該化合物進(jìn)行的吸收光譜和熒光掃描顯示，其吸收峰位于 550 nm，熒光峰位于 570 nm（見圖 1）。1×工作液的 PHDH1 足夠用于染色 300-350 片蓋玻片（22×22 mm）上的細(xì)胞（見圖 2）。  

注意：鬼筆環(huán)肽有毒，必須小心處理（人類 LD50 = 2 mg/kg）。  

圖 1：Acti-stain? 555 的吸收光譜和熒光掃描  

圖例：標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽被稀釋到甲醇中，其吸收光譜和激發(fā)光譜分別在 250-750 nm 和 550-750 nm 范圍內(nèi)掃描。吸收峰位于 550 nm，熒光位于 570 nm。

圖 2：Swiss 3T3 細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維  

圖例：Swiss 3T3 細(xì)胞在玻璃蓋玻片上生長(zhǎng)至半融合狀態(tài)，并用 Acti-stain? 555 鬼筆環(huán)肽和 DAPI（核染料）按方法描述進(jìn)行固定和染色。細(xì)胞在配備 TRITC 濾光片組（535Ex/585Em 濾光片組）、數(shù)字 CCD 相機(jī)和 100×物鏡的熒光顯微鏡下觀察。注意細(xì)胞中遍布的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維（紅色）。

儲(chǔ)存與復(fù)溶  

短暫離心以使產(chǎn)品聚集在管底。用 500 ?L 100% 甲醇復(fù)溶，制備 14 ?M 的溶液。建議將溶液保存在 -20°C 的一個(gè)瓶中，可穩(wěn)定保存 6 個(gè)月。凍干產(chǎn)品在 4°C 干燥條件下（濕度<10%）可穩(wěn)定保存 6 個(gè)月。

應(yīng)用 ：免疫熒光  

用于組織培養(yǎng)細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白絲熒光染色的方法有多種。固定程序?qū)τ讷@得細(xì)胞內(nèi) F-肌動(dòng)蛋白分布的真實(shí)表示至關(guān)重要。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇固定方法。用甲醛或戊二醛固定組織培養(yǎng)細(xì)胞可獲得出色的肌動(dòng)蛋白絲染色效果和良好的片狀偽足保存效果。

試劑  

1. Acti-stain? 555 鬼筆環(huán)肽（貨號(hào)：PHDH1）  

2. 在玻璃蓋玻片上生長(zhǎng)至半融合狀態(tài)的 Swiss 3T3 細(xì)胞  

3. 要么從 Cytoskeleton, Inc. 購(gòu)買 F-肌動(dòng)蛋白染色試劑盒（貨號(hào)：BK005），要么準(zhǔn)備以下 4-7 項(xiàng)試劑  

4. 磷酸鹽緩沖液（PBS，20 mM 磷酸鉀，pH 7.4，150 mM NaCl）  

5. 固定液（PBS 中的 3.7% 甲醛，pH 需調(diào)至 7.0）  

6. 通透緩沖液（PBS 中的 0.5% Triton X-100）  

7. 抗褪色封片介質(zhì)（Fluka BioChemika，貨號(hào)：10981）  

8. PBS 中的 100 nM DAPI（4’6-二氨基-2-苯基吲哚）  

9. 顯微鏡載玻片（25×75×1 mm）  

10. 封片液（透明指甲油）

設(shè)備  

1. 熒光顯微鏡，配備用于 Acti-stain? 555 的 TRITC 激光激發(fā)濾光片（535±20 nm）和發(fā)射濾光片（585±20 nm），以及用于 DAPI 的激發(fā)濾光片（355±20 nm）和發(fā)射濾光片（440±20 nm）。  

2. 數(shù)字 CCD 相機(jī)。

Acti-stain555鬼筆環(huán)肽文獻(xiàn)參考：

1. Wulf, E. et al. (1979). Proc Natl Acad Sci USA. 76(9):4498-4502.

2. Kron, S.J. et al. (1991).  Meth. Enzmol. 196: 399-416.