Calcein-AM是一種常用的對活細胞進行熒光標(biāo)記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。 因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM細胞毒性極低，適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此，Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯(lián)合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。本試劑盒適用于熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀、流式細胞儀以及其他熒光檢測系統(tǒng)。

艾美捷的一款基于Calcein AM和PI的活死細胞雙染試劑盒(B-CHK103)，本染色方法適用于熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀等微孔板熒光掃描設(shè)備、流式細胞儀或其他的熒光設(shè)備。本染色方法適用于大多數(shù)真核細胞，包括貼壁細胞和某些組織樣本，但不包括細菌和酵母樣本。   

Calcein-AM/PI，活細胞/死細胞雙染試劑盒組件和存儲：

注：500T是指當(dāng)使用Calcein AM的2μmol/L工作溶液/PI的Landa工作溶液4.5μmol/L時可實現(xiàn)的檢測次數(shù)，每次使用總計100μL。

Calcein-AM/PI，活細胞/死細胞雙染試劑盒染色方案：

1、制備1mM Calcein AM儲備溶液。將200μL二甲基亞砜加入含有200μg Calcein AM粉末的試管中，并使用移液管渦旋溶解。將溶液儲存在避光的地方，并盡快使用，以避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

2、使用前將Calcein AM儲備溶液和PI儲備溶液置于室溫。使用PBS制備工作溶液。

1）Calcein AM工作溶液的推薦濃度為2μmol/L，PI工作溶液的建議濃度為4.5μmol/L

2）工作溶液濃度可以根據(jù)細胞的具體要求進行調(diào)整，建議在使用前立即準(zhǔn)備染色工作溶液。

3）將100μL染色工作溶液與200μL細胞懸浮液混合，在37°C下孵育15分鐘。

4）觀察顯示黃綠色熒光的活細胞和顯示紅色熒光的死細胞，同時在490±10nm的激發(fā)下。此外，在545的激發(fā)下單獨觀察死細胞nm。

僅供研究使用，不用于人類或臨床診斷。

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