血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種≈12kD的陽性急性期蛋白，以杠桿形式表達(dá)并在血液中循環(huán)。它是包括駱駝科在內(nèi)的許多物種炎癥和疾病的有用生物標(biāo)志物。1該檢測方法可識別駱駝和羊駝血清中的SAA。與駱駝SAA的反應(yīng)性尚未得到調(diào)查。

該檢測使用兩種不同的肽特異性駱駝SAA抗體；一種用于固相固定（微量滴定孔），另一種與辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合用于檢測。將標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋樣品與HRP綴合物一起在微量滴定孔中孵育一小時。這導(dǎo)致SAA分子夾在固定抗體和檢測抗體之間。然后洗滌孔以去除未結(jié)合的HRP綴合物。加入TMB并孵育20分鐘。如果SAA存在，則會出現(xiàn)藍(lán)色。通過添加Stop溶液停止顯色，將顏色變?yōu)辄S色，并在450nm處測量吸光度。SAA的濃度與吸光度成正比，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。

艾美捷Life Diagnostics試劑盒提供的材料：

包被血清淀粉樣蛋白A（SAA）抗體的96孔板（12條8孔條）

辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合物，11毫升

血清淀粉樣蛋白A（SAA）標(biāo)準(zhǔn)品（凍干）

20倍洗滌液；TBS50-20，50毫升

稀釋液；CSD50-1，50毫升

四甲基聯(lián)苯胺（TMB），TMB11-1，11毫升

終止液，SS11-1，11毫升

未提供但必需的材料：

移液器和吸頭

蒸餾水或去離子水

聚丙烯或玻璃試管

渦旋混合器

水浴

吸水紙或紙巾

板式孵育器/振蕩器

板式洗板機(jī)

能夠測量450納米吸光度的板式閱讀器

曲線擬合軟件

保存：

SAA庫存應(yīng)儲存在-20℃或以下。試劑盒的剩余部分應(yīng)儲存在2-8°C的溫度下，微量滴定板應(yīng)保存在帶干燥劑的密封袋中。套件自購買之日起六個月內(nèi)保持穩(wěn)定。

標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：

按照瓶簽上的說明重新溶解血清淀粉樣蛋白A（SAA）標(biāo)準(zhǔn)品。使用前輕輕混合數(shù)次。標(biāo)準(zhǔn)品不需要加熱處理。

標(biāo)記7個聚丙烯試管為500、250、125、62.5、31.25、15.63和7.81 ng/ml。

在標(biāo)記為500 ng/ml的試管中，根據(jù)SAA標(biāo)準(zhǔn)品瓶簽上詳細(xì)說明的量取適量的稀釋液。然后加入指示體積的標(biāo)準(zhǔn)品并輕輕混合。這便提供了500 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。

在標(biāo)記為250、125、62.5、31.25、15.63和7.81 ng/ml的試管中分別加入250 ?l的稀釋液。

將250 ?l的500 ng/ml SAA標(biāo)準(zhǔn)品吸入標(biāo)記為250 ng/ml的試管并混合。這便提供了250 ng/ml的SAA標(biāo)準(zhǔn)品。

類似地，通過兩倍連續(xù)稀釋準(zhǔn)備其余的標(biāo)準(zhǔn)品。如果不打算立即使用剩余的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)將其冷凍存儲在-20°C或更低的溫度下。

樣品準(zhǔn)備：

Life Diagnostics的研究表明，駱駝血清至少應(yīng)稀釋4倍。除非稀釋50倍或更多，否則不應(yīng)使用血漿。最佳稀釋比例應(yīng)由研究者確定。

檢測程序：

將所需數(shù)量的8孔條固定在支架中。未使用的條應(yīng)存放在重新密封的袋子里，并與干燥劑一起存放在2-8°C下以備將來使用。

向孔中加入100 ?l的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品（我們建議標(biāo)準(zhǔn)品和樣品運(yùn)行兩次）。

向每個孔中加入100 ?l的HRP結(jié)合物。

在25°C下，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速率在板式振蕩器上孵育一小時。

使用板式洗板機(jī)（每孔400 ?l）用1x洗滌液洗孔5次。

將孔猛擊在吸水紙或紙巾上以去除所有殘留的液滴。

向每個孔中加入100 ?l的TMB。

在25°C下，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速率在軌道式微孔板振蕩器上孵育20分鐘。

20分鐘后，向每個孔中加入100 ?l的終止液以停止反應(yīng)。

輕輕混合。確保所有藍(lán)色變?yōu)辄S色非常重要。

在5分鐘內(nèi)，使用板式閱讀器讀取450 nm處的吸光度。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：

下圖展示了一個典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以450納米處的吸光度作為Y軸，相對于X軸上的血清淀粉樣蛋白A（SAA）濃度。這個曲線僅用于說明。

參考文獻(xiàn)：

1. El-Deeb WM, Fouda TA and El-Bahr SM. Clinico-biochemicalinvestigation of paratuberculosis of dromedary camels in SaudiArabia: Proinflammatory cytokines, acute phase proteins andoxidative stress biomarkers. http://www.pvj.com.pk/in_press/13-534.pdf (2014)

Life Diagnostics 專注于研發(fā)和生產(chǎn)臨床前研究以及動物醫(yī)學(xué)診斷相關(guān)的ELISA試劑盒、純化的生物標(biāo)志物和抗體等產(chǎn)品。產(chǎn)品覆蓋心血管疾病、急性期反應(yīng)、免疫毒性和免疫學(xué)標(biāo)志物等研究領(lǐng)域，主要應(yīng)用于小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、猴和雞等物種。艾美捷科技是Life Diagnostics的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。