磷酸化 4EBP1（T37/T46）+ 總 4EBP1 檢測(cè)試劑盒是一種均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）夾心免疫檢測(cè)法（圖 1）。THUNDER? 細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)試驗(yàn)流程包括 3 個(gè)步驟（圖 2）。細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，首先使用試劑盒提供的專用裂解緩沖液將細(xì)胞裂解。然后在不同的孔中，分別使用兩對(duì)熒光標(biāo)記的抗體以簡(jiǎn)單的“添加 - 孵育 - 測(cè)量”格式（單步試劑添加；無(wú)需洗滌步驟）檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的磷酸化 4EBP1（T37/T46）和總 4EBP1。對(duì)于磷酸化蛋白的檢測(cè)，一個(gè)抗體標(biāo)記有供體熒光團(tuán)（Europium 配合物；Eu-Ab1），另一個(gè)標(biāo)記有遠(yuǎn)紅光受體熒光團(tuán)（FR-Ab2）。檢測(cè)總蛋白的第二對(duì)抗體對(duì)（Eu-Ab3 和 FR-Ab4）也采用相同的方法。兩種匹配的標(biāo)記抗體結(jié)合到目標(biāo)蛋白（磷酸化 4EBP1 或總 4EBP1）的不同表位上，使兩種染料靠近。用閃光燈（320 或 340 nm）或激光（337 nm）激發(fā)供體 Europium 配合物分子，會(huì)觸發(fā)從供體到受體分子的 FRET，受體分子隨后在 665 nm 處發(fā)射 TR-FRET 信號(hào)。Eu 配合物的剩余能量在 615 nm 處產(chǎn)生光。665 nm 處的信號(hào)與細(xì)胞裂解液中磷酸化 4EBP1（T37/T46）和總 4EBP1 的濃度成正比。數(shù)據(jù)可以表示為 665 nm 處的信號(hào)，或 665 nm/615 nm 的比值。

作為BioAuxilium在中國(guó)區(qū)域合作伙伴，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BioAuxilium熱銷產(chǎn)品THUNDER 磷酸-4EBP1（T37/T46）+總4EBP1 TR-FRET細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

THUNDER 磷酸-4EBP1（T37/T46）+總4EBP1 TR-FRET細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)試劑盒組分：

銪磷-4EBP1（20uL）

鈣磷-4EBP1（80uL）

銪總量4EBP1（5uL）

Acc總計(jì)4EBP1（20uL）

4EBP1對(duì)照裂解液（200uL）

5X裂解緩沖液2（5 mL）

10倍TR-FRET檢測(cè)緩沖液（250uL）

100X磷酸酶抑制劑雞尾酒（250uL）

驗(yàn)證數(shù)據(jù)：

該試劑盒已通過(guò)驗(yàn)證，可用于 A431 和 HEK293 細(xì)胞裂解液中磷酸化 4EBP1（T37/T46）和總 4EBP1 的相對(duì)定量檢測(cè)，采用雙板檢測(cè)協(xié)議。

貼壁細(xì)胞在 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過(guò)夜（HEK293 使用 EMEM + 10% 胎牛血清；A431 使用 DMEM + 10% 胎牛血清）。用于 HEK293 的培養(yǎng)板預(yù)先涂覆了聚-L-賴氨酸。

細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，移除培養(yǎng)基，然后用添加了磷酸酶抑制劑（1 mM 氟化鈉和 2 mM 偏釩酸鈉）的 1X 裂解緩沖液 2（50 uL）將細(xì)胞裂解。

在室溫下于振蕩器（400 rpm）孵育 30 分鐘后，將裂解液（15 uL）轉(zhuǎn)移到 384 孔檢測(cè)板中，然后分別加入用于檢測(cè)磷酸化 4EBP1（T37/T46）的標(biāo)記抗體 Eu-Ab1 和 FR-Ab2（5 uL），或用于檢測(cè)總 4EBP1 的 Eu-Ab3 和 FR-Ab4（5 uL）。

在室溫下孵育 4 小時(shí)后，記錄 665 nm 和 615 nm 處的 TR-FRET 信號(hào)（使用 EnVision，閃光燈激發(fā)）。

BioAuxilium成立于2013年，基于其專有的TR-FRET技術(shù)，開(kāi)發(fā)出了數(shù)百個(gè)用于細(xì)胞蛋白和生物標(biāo)志物定量分析的Thunder系列TR-FRET檢測(cè)試劑盒。該公司專注于設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)高質(zhì)量、經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證的TR-FRET檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)室工作流程，加速生物醫(yī)學(xué)研究。

作為BioAuxilium在中國(guó)區(qū)域合作伙伴，艾美捷科技有限公司將為中國(guó)客戶提供全面的BioAuxilium產(chǎn)品以及客戶訂制化服務(wù)，歡迎大家隨時(shí)聯(lián)系我們。