引言

當代水凝膠基質(zhì)為2D和3D細胞培養(yǎng)提供了巨大的優(yōu)勢。它們提供了一個模擬天然組織的環(huán)境，提高了生長速度，并提供了可以可靠地測定天然體內(nèi)細胞行為的條件。水凝膠基質(zhì)的選擇包括來自基于動物的細胞外基質(zhì)（ECMs）的那些，如Matrigel和TheWell Biosciences無動物源的VitroGel 水凝膠。在任何一種情況下，一旦細胞被培養(yǎng)，通常需要從水凝膠基質(zhì)中回收細胞或類器官用于后續(xù)研究。

從水凝膠中回收細胞或類器官需要專門的程序來確保活細胞的產(chǎn)量。然而，從基于動物的ECMs中回收的傳統(tǒng)方法帶來了額外的挑戰(zhàn)，例如需要低溫、冗長的程序、低細胞活力以及回收過程中使用的材料保質(zhì)期有限。由于細胞或類器官回收的目標通常是為下游應用進行傳代培養(yǎng)，因此克服這些挑戰(zhàn)對于滿足廣泛的用戶需求至關(guān)重要。TheWell Bioscience的VitroGel 類器官回收溶液可以滿足這些需求，允許在室溫下、無酶的回收程序，在中性pH下進行，僅需10-15分鐘即可完成。該溶液及其優(yōu)化的方案允許從3D培養(yǎng)和2D ECM涂層板中收獲細胞。

在這項比較研究中，我們專注于使用我們的VitroGel 類器官回收溶液的新配方從Matrigel中收獲類器官，并與我們原來的VitroGel 細胞回收溶液和另一種領(lǐng)先的類器官回收溶液進行測試。我們使用不同的方法進行這些比較，以評估三種選擇的整體穩(wěn)健性。我們的新溶液也兼容用于從2D Matrigel涂層板中收獲干細胞，這使其成為用于3D和2D應用的基于動物的ECM解離的強大工具。

材料和方法

材料 

使用類器官和細胞來比較不同回收系統(tǒng)和實驗條件的效率。采用小鼠腸類器官（MIOs）進行類器官回收試驗，而采用人類iPSCs（誘導多能干細胞）進行2D細胞回收試驗。Matrigel（Corning，類器官等級：356255）用于初始細胞/類器官培養(yǎng)。VitroGel 細胞回收溶液（TheWell Biosciences; SKU = MS03）、VitroGel 類器官回收溶液（TheWell Biosciences; SKU = MS04）、Solution RLR（公司SC）和Solution 3OHS（公司SA）用作培養(yǎng)后回收類器官或細胞的介質(zhì)。

細胞培養(yǎng)

MIOs在24孔板的每個孔中以Matrigel圓頂（25 μL/圓頂）培養(yǎng)3天，每個孔1 mL培養(yǎng)基，然后回收。對于2D培養(yǎng)，人類iPSCs在6孔Matrigel涂層板中培養(yǎng)3天。在類器官或細胞回收之前，從每個板中移除培養(yǎng)基。

回收

對于MIOs，將1mL冷（4°C）VitroGel類器官回收溶液（MS04）或VitroGel細胞回收溶液（MS03）添加到24孔板的孔中，以重新懸浮類器官-Matrigel圓頂。再添加另外1 mL的MS04或MS03以清洗板子，并將溶液與管子結(jié)合。輕輕用移液管混合，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，然后在冰上或冰箱里冷卻2-5分鐘（MS04）或10分鐘（MS03）以進行ECM解離。Solution MS03最初設計用于從VitroGel中收獲細胞，并非為基于動物的ECM使用而設計。此時，比較了兩種不同的攪拌方法。在方法1中，預期更適合擴展，類器官被輕輕用移液管上下5-10次以打破成小片段。在方法2中，預期更適合完整收獲以用于下游分析，試管在沒有使用移液管的情況下?lián)u動2分鐘以產(chǎn)生完整的類器官。在4°C下以100 x g離心3-5分鐘以收集類器官。還比較了兩種VitroGel回收溶液與兩種其他領(lǐng)先的類器官回收溶液（RLR和3OHS）之間的回收特性。對于這些溶液，孵育時間為15分鐘，在冰上，而不是上述條件。然后所有條件下收獲的類器官都準備好進行分析或次級培養(yǎng)在Matrigel中。

對于iPSCs，在從2D Matrigel涂層6孔板中移除培養(yǎng)基后，向每個孔中添加2 mL的PBS溶液。然后在每個孔中添加1 mL的VitroGel類器官回收溶液。將板子在37 °C下孵育3-5分鐘。然后在每個孔中添加1 mL的培養(yǎng)基，并將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中。用額外的1 mL培養(yǎng)基兩次洗滌板子，然后將所有的洗滌液結(jié)合到離心管中。在4°C下以100 x g離心3-5分鐘，去除上清液，此時沉淀中的細胞準備好進行次級培養(yǎng)、分析或儲存。

分析 

回收后的類器官和細胞在回收后0、1和2天以及在Matrigel次級培養(yǎng)期間進行成像，以評估完整性和整體形態(tài)水平。圖像用于比較不同生物類型（類器官vs.細胞）、不同的回收溶液和回收過程中采用的不同技術(shù)的有效性的完整性回收，如上所述。

結(jié)果

首先，我們評估了類器官收集過程中物理攪拌類型對回收的類器官特征的影響。方法1，輕輕吹打，導致更分散的類器官，可以容易地分布到多個容器中，而方法2，離心管搖動，導致更聚集的類器官，可以容易地直接收獲（圖1）。這些特征在整個2天的分析期間持續(xù)存在（圖1）。

圖1. 使用VitroGel類器官回收溶液從Matrigel中回收類器官。使用了兩種不同的物理回收方法。方法1（頂部序列）：使用移液器將類器官輕輕破碎成小片段用于傳代培養(yǎng)/擴增。方法2（底部序列）：搖動含有回收溶液和類器官的離心管，不使用移液器以回收更完整的類器官。

接下來，我們比較了VitroGel類器官回收溶液（MS04）和VitroGel細胞回收溶液（MS03）的回收效率（圖2）。在離心收集類器官后，MS04溶液中的Matrigel完全溶解，而對于MS03溶液，類器官頂部有少量軟凝膠殘留。雖然兩種溶液都導致了健康的類器官擴增，并且可以隨后收獲或傳代培養(yǎng)類器官，但較新的VitroGel類器官回收溶液（MS04）顯示出比舊的VitroGel細胞回收溶液（MS03）更高的回收效率。

圖2. VitroGel類器官回收溶液（頂部）與舊的VitroGel細胞回收溶液（底部）的比較。類器官在Matrigel中培養(yǎng)三天后收獲。上圖顯示了兩種細胞回收溶液的健康類器官擴增，但較新的VitroGel類器官回收溶液顯示出更高的回收效率。

為了將VitroGel類器官回收溶液與市場上其他領(lǐng)先的回收溶液進行比較，我們必須改變孵育時間和溫度，將前者從2分鐘延長到15分鐘，并將后者從室溫降低到冰浴。VitroGel類器官回收溶液與RLR和3OHS溶液的比較回收特性如圖3所示。雖然在VitroGel類器官回收溶液中孵育后所有原始Matrigel都溶解，但在RLR或3OHS中孵育后大部分凝膠仍然存在。此外，通過移液器從VitroGel類器官回收溶液中重懸證明是容易的，而從RLR或3OHS中重懸證明是困難的。因此，細胞回收率最好的是VitroGel類器官回收溶液，其次是RLR，然后是3OHS。從VitroGel類器官回收溶液中回收的類器官在回收后5天顯示出比其他兩種溶液更完整的形態(tài)（圖3）。

圖3. VitroGel類器官回收溶液（頂部）與其他類器官回收溶液的比較。Solution RLR來自Company SC，Solution 3OHS來自Company SA。回收技術(shù)的差異在正文中描述。與其他兩種溶液不同，使用MS04溶液回收的類器官可以更容易地重懸在細胞培養(yǎng)基中，并且可以更容易地破碎成小片段用于傳代培養(yǎng)。

最后，我們分析了使用新的VitroGel器官樣本恢復溶液從2D Matrigel涂層培養(yǎng)板中收獲細胞的有效性。通過顯微鏡成像，明顯看到人類iPSCs可以在恢復液中孵育僅3分鐘后就可以輕松從培養(yǎng)皿中解離出來（圖4）。此外，這個程序?qū)е铝藢⒓毎耆珡奈⒖装灞砻嫒コ⒃陔S后的3天重新在Matrigel中培養(yǎng)中呈現(xiàn)出強健的形態(tài)（圖4）

圖 4. 使用 VitroGel 類器官回收溶液從 2D Matrigel 涂層板中收獲 iPSC。VitroGel 類器官回收溶液可用于從 Matrigel 中收獲 iPSC 細胞。A）在添加 VitroGel 類器官回收溶液 3 分鐘后，從 Matrigel 涂層板上分離的細胞的形態(tài)。B）細胞收獲后 6 孔板表面的圖像，顯示所有細胞均從 Matrigel 涂層板上移除。C）重新接種到新的 Matrigel 涂層板上的細胞的形態(tài)（第 3 天）。

討論

上述結(jié)果強調(diào)了 VitroGel 類器官回收溶液在基于動物的 ECM（Matrigel）中培養(yǎng)后有效回收類器官和細胞的幾個優(yōu)點。

首先，對于類器官，使用 VitroGel 類器官回收溶液時，在時間上有明顯的節(jié)省，并且溫度使用方便（即室溫或以上）。

其次，可以使用這種溶液采用兩種不同但簡單的物理攪拌方法來產(chǎn)生可定制用于不同下游應用的類器官聚集形態(tài)。例如，使用 VitroGel 類器官回收溶液進行回收可以輕松地將類器官破碎成小片段用于后期擴增。

第三，使用 VitroGel 類器官回收溶液后，凝膠解離容易且明顯。如果凝膠不解離，則很難通過移液器將其破碎成小片段。這是因為凝膠的粘度；移液器的剪切力不足以在高粘度混合物中破碎類器官。然而，VitroGel 類器官回收溶液避免了所有這些問題，并且比兩種領(lǐng)先的比較器回收溶液更能夠做到這一點。

最后，我們還展示了 VitroGel 類器官回收溶液的多功能性，因為它也可用于在 Matrigel 涂層板上培養(yǎng)后實現(xiàn)人類細胞的高效和輕松分離。因此，可以在不使用機械力的情況下實現(xiàn) 2D 干細胞收獲的溫和分離，為用戶提供高細胞產(chǎn)量和高細胞活力。

總之，我們在這里進行的分析和比較表明，TheWell Bioscience 的 VitroGel 類器官回收溶液（MS04）是從基于動物的 ECM 中快速高效地回收類器官/細胞的優(yōu)越解決方案。

鏈接到使用的產(chǎn)品

1. VitroGel 類器官回收溶液：MS04-100，MS04-500

2. VitroGel 細胞回收溶液：MS03-100

參考文獻

Risbridger, P., Lawrence, M. G., & Taylor, R. A. (2020). PDX: Moving Beyond Drug Screening to Versatile Models for Research Discovery. Journal of the Endocrine Society 4(11). https://doi.org/10.1210/jendso/bvaa132

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