【前情回顧】ELISpot實(shí)驗(yàn)指南：從入門到精通

外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）至少在人樣本中，是ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗(yàn)中使用最廣泛的細(xì)胞類型。PBMCs可以通過(guò)密度梯度離心（例如使用Ficoll-Paque）輕松從血液中分離。分離后的細(xì)胞可以直接使用，也可以選擇進(jìn)行冷凍保存，以便在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)使用。這是一份關(guān)于如何最佳分離、冷凍和解凍PBMCs的詳細(xì)指南。

1. 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的分離

對(duì)于全血的收集，市面上有各種帶有不同抗凝劑的采血管可供選擇。根據(jù)Mabtech的經(jīng)驗(yàn)，使用檸檬酸鹽和肝素的采血管最適合用于ELISpot實(shí)驗(yàn)。如果需要大量細(xì)胞，也可以從白細(xì)胞層（buffy coat）中制備PBMCs，白細(xì)胞層是在去除血漿和大部分紅細(xì)胞后得到的白細(xì)胞濃縮物。

自備材料：血液樣本（全血或白細(xì)胞層）；無(wú)菌的Ficoll-Paque；無(wú)菌的PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基（例如RPMI 1640）；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無(wú)菌；吸管和移液器；無(wú)菌巴氏吸管（塑料或玻璃）；自動(dòng)移液器和無(wú)菌吸頭；室溫離心機(jī)

PBMCs的分離步驟：

1. 全血：用PBS將血液稀釋2倍（例如，10ml血液+10ml PBS）。白細(xì)胞層：白細(xì)胞層中的細(xì)胞密度比全血更高，因此需要稀釋更多（大約3倍）。  

2. 準(zhǔn)備含有Ficoll-Paque的離心管。根據(jù)血液體積，選擇15ml管或50ml管。如果使用15ml管，加入5ml Ficoll-Paque；如果使用50ml管，加入15ml Ficoll-Paque。  

3. 小心地將稀釋后的血液輕輕加在Ficoll-Paque層的上方，避免破壞界面。對(duì)于15ml管，加入8ml稀釋后的血液；對(duì)于50ml管，加入25ml稀釋后的血液。**提示：** 在加樣時(shí)，將移液管靠在管壁上，并傾斜試管。  

4. 在室溫下，以400×g的速度離心30分鐘，離心過(guò)程中不使用制動(dòng)。  

5. 離心后，在Ficoll-Paque層上方會(huì)形成一層白色至灰白色的單個(gè)核細(xì)胞層。小心地用巴氏吸管收集單個(gè)核細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。或者，也可以先去除一部分血漿層，再收集單個(gè)核細(xì)胞。注意，不要將來(lái)自超過(guò)兩個(gè)Ficoll管的細(xì)胞合并，并且保持體積（不超過(guò)試管體積的一半）。用PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基將新管加滿。  

6. 通過(guò)離心新管10分鐘（400×g）來(lái)洗滌細(xì)胞。  

7. 棄去上清液，重懸沉淀，并加入PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基。**提示：** 在重懸細(xì)胞時(shí)，先輕敲試管使細(xì)胞沉淀變得不那么緊密。然后加入1-2ml緩沖液/培養(yǎng)基，緩慢上下吸打溶液，再將試管加滿。  

8. 通過(guò)離心新管10分鐘（400×g）來(lái)洗滌細(xì)胞。  

9. 棄去上清液，重懸沉淀，并加入無(wú)血清培養(yǎng)基。  

10. 記錄體積，并取少量樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。  

11. 以400×g的速度離心10分鐘來(lái)洗滌細(xì)胞。**提示：** 在這一步進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。**提示：**經(jīng)過(guò)Ficoll分離后，可能會(huì)存在殘留的紅細(xì)胞（RBC）和粒細(xì)胞。如果需要，可以使用市售的試劑來(lái)去除這些細(xì)胞。（例如“RBC裂解緩沖液”和“粒細(xì)胞去除劑”）

12. 如果您想立即使用細(xì)胞，棄去上清液，通過(guò)輕輕上下吸打，用適量的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。PBMCs現(xiàn)在可以用于基于細(xì)胞的免疫分析，如ELISpot、FluoroSpot和流式細(xì)胞術(shù)。如果您想冷凍保存細(xì)胞，則可參考如下“PBMCs的冷凍保存”部分。

2. 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的凍存

標(biāo)記冷凍管，并確保冷凍容器已準(zhǔn)備好。將細(xì)胞在室溫下長(zhǎng)時(shí)間置于冷凍培養(yǎng)基中可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生負(fù)面影響。

自備材料：冷凍培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 20%胎牛血清（FCS）和10%二甲基亞砜（DMSO）。如果您的細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基，請(qǐng)使用7% DMSO； 冷凍管，例如1.8ml；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無(wú)菌；冷凍容器，例如“CoolCell”或“Mr. Frosty”；自動(dòng)移液器和無(wú)菌吸頭；-80℃冰箱；-150℃冰箱或液氮罐

PBMCs的凍存步驟：

1. 棄去上清液（來(lái)自前一部分的第11步），并將細(xì)胞用冷凍培養(yǎng)基稀釋至每毫升500萬(wàn)到2500萬(wàn)細(xì)胞的濃度。如果您使用的是無(wú)血清冷凍培養(yǎng)基，則應(yīng)將細(xì)胞濃度調(diào)整至每毫升100萬(wàn)細(xì)胞。

2. 將細(xì)胞分裝至冷凍管中，例如每管1毫升，并將冷凍管轉(zhuǎn)移到冷凍容器中。確保通過(guò)持續(xù)重懸保持細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)。 **提示：** 對(duì)于1.8毫升的冷凍管，每管分裝1毫升細(xì)胞懸浮液。對(duì)于其他尺寸的冷凍管，務(wù)必確保分裝的體積小于最大容量，因?yàn)橐后w在冷凍過(guò)程中會(huì)膨脹。

3. 迅速將冷凍容器放入-80℃冰箱中，至少保存4小時(shí)，最多保存1周。

4. 將冷凍管從冷凍容器轉(zhuǎn)移到-150℃冰箱或液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

3. 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的解凍

將水浴加熱至37℃。提前將用于第2步的細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)熱。在后續(xù)的洗滌步驟中使用的培養(yǎng)基保持室溫即可。

自備材料：細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 10%胎牛血清（FCS）、10 mM HEPES、100 ug/ml青霉素+100 ug/ml鏈霉素；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無(wú)菌；吸管和移液器；自動(dòng)移液器和無(wú)菌吸頭；室溫離心機(jī)；37℃水浴；37℃、5% CO?培養(yǎng)箱

PBMCs的解凍步驟：

1. 迅速將冷凍管從冷凍保存處轉(zhuǎn)移到37℃水浴中，解凍細(xì)胞直到僅剩小冰晶。**提示：** 如果打算解凍多個(gè)冷凍管，每次只解凍幾個(gè)。冷凍培養(yǎng)基中含有DMSO，DMSO對(duì)細(xì)胞有毒，因此請(qǐng)盡快進(jìn)行第2步。

2. 慢慢向冷凍管中加入0.5-1ml預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞從冷凍管轉(zhuǎn)移到15ml管中。用1ml細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗冷凍管，并將其轉(zhuǎn)移到15ml管中。用細(xì)胞培養(yǎng)基將管子加滿。

3. 通過(guò)離心（300×g，10分鐘）洗滌細(xì)胞。

4. 棄去上清液，輕敲管子使沉淀變得不那么緊密。通過(guò)緩慢上下吸打，用1ml細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。加入細(xì)胞培養(yǎng)基，使總體積達(dá)到15ml。

5. 以300×g的速度離心10分鐘。

6. 棄去上清液，用1ml細(xì)胞培養(yǎng)基重懸沉淀。根據(jù)預(yù)期的細(xì)胞數(shù)量和所需的細(xì)胞濃度，加入額外的細(xì)胞培養(yǎng)基（例如5ml）。

7. 將細(xì)胞放入CO?培養(yǎng)箱中放置1小時(shí)。將蓋子稍微打開(kāi)。**提示：**利用這一個(gè)小時(shí)的空閑時(shí)間來(lái)清洗和封閉你的ELISpot/FluoroSpot板。

8. 孵育（細(xì)胞靜置）后，重懸細(xì)胞并讓任何聚集的細(xì)胞碎片沉淀（大約需要1分鐘）。然后小心地將細(xì)胞懸浮液（不包括碎片）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的15ml管中。**提示：** 每個(gè)15ml管最多加入兩個(gè)冷凍管的細(xì)胞（或大約3000萬(wàn)到4000萬(wàn)細(xì)胞）。

9. 計(jì)數(shù)細(xì)胞并確定細(xì)胞活性。可以使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或通過(guò)顯微鏡使用臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。因?yàn)橹挥谢罴?xì)胞才能分泌分析物，所以在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)務(wù)必排除死細(xì)胞，如果可能的話，還要排除凋亡細(xì)胞。如果細(xì)胞濃度低于所需濃度，再次離心細(xì)胞，重懸并稀釋至所需的體積。

PBMCs細(xì)胞制備好后，即可準(zhǔn)備進(jìn)行ELISpot實(shí)驗(yàn)。Mabtech作為ELISpot領(lǐng)域研究專家，可提供高品質(zhì)人的ELISpot試劑盒：