【前情回顧】ELISpot實(shí)驗(yàn)指南：從入門(mén)到精通

脾細(xì)胞（Splenocytes）至少在小鼠和大鼠樣本中，是ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗(yàn)中使用最廣泛的細(xì)胞類型。脾細(xì)胞可以從脾臟中輕松分離，無(wú)需使用Ficoll分離。分離后的細(xì)胞可以直接使用，或者也可以選擇將細(xì)胞冷凍保存，以便在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)使用。

1. 脾細(xì)胞（Splenocytes）分離

取下小鼠或大鼠的脾臟后立即放入裝有5ml培養(yǎng)基的無(wú)菌離心小瓶中。

自備材料：70um尼龍細(xì)胞篩，無(wú)菌；剪刀和鑷子或鉗子，無(wú)菌；培養(yǎng)皿，無(wú)菌  

巴氏吸管，無(wú)菌；無(wú)菌注射器，3ml或5ml（不帶針頭）；聚丙烯離心管：15ml，無(wú)菌；培養(yǎng)基：含100ug/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素的RPMI 1640

脾細(xì)胞分離步驟：

1. 將脾臟轉(zhuǎn)入一個(gè)培養(yǎng)皿中。如果需要，使用剪刀和鑷子或鉗子去除多余的脂肪和組織。

2. 在一個(gè)新的培養(yǎng)皿中放置一個(gè)細(xì)胞篩，將脾臟轉(zhuǎn)移到細(xì)胞篩中。加入5ml培養(yǎng)基。

3. 使用注射器的平頭柱塞將脾臟通過(guò)細(xì)胞篩研磨到培養(yǎng)皿中。

4. 用5ml培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞篩，將液體沖入培養(yǎng)皿。

5. 將脾細(xì)胞從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到一個(gè)15ml的離心管中。

6. 讓離心管靜置一分鐘，使大的細(xì)胞團(tuán)沉淀，或者使用無(wú)菌的巴氏吸管去除細(xì)胞團(tuán)和聚集物。將脾細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的15ml離心管中。用培養(yǎng)基將離心管加滿。

7. 以300×g的速度離心10分鐘。

8. 棄去上清液，用15ml培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。

9. 記錄體積，并取少量樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

10. 以300×g的速度離心10分鐘。   **提示！** 在這一步進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

11. 如果您想立即使用細(xì)胞：棄去上清液，通過(guò)輕輕上下吸打，用適量的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。脾細(xì)胞現(xiàn)在可以用于基于細(xì)胞的免疫分析，如ELISpot、FluoroSpot和流式細(xì)胞術(shù)。如果您想冷凍保存細(xì)胞，參考如下“脾細(xì)胞的冷凍保存”。

2. 脾細(xì)胞（Splenocytes）的冷凍保存

開(kāi)始之前，標(biāo)記冷凍管，并確保冷凍容器已準(zhǔn)備好。將細(xì)胞在室溫下長(zhǎng)時(shí)間置于冷凍培養(yǎng)基中會(huì)影響細(xì)胞活性。

自備材料：冷凍培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 20%胎牛血清（FCS）和10%二甲基亞砜（DMSO）。如果您的細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基，請(qǐng)使用7% DMSO；

冷凍容器，例如“CoolCell”或“Mr. Frosty”；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無(wú)菌；自動(dòng)移液器和無(wú)菌吸頭；冷凍管，例如1.8ml;-80℃冰箱；-150℃冰箱或液氮罐。

脾細(xì)胞冷凍步驟：

1. 棄去上清液（來(lái)自第1部分的第11步），并將細(xì)胞用冷凍培養(yǎng)基稀釋至每毫升500萬(wàn)到2500萬(wàn)細(xì)胞的濃度。如果您使用的是無(wú)血清冷凍培養(yǎng)基，則應(yīng)將細(xì)胞濃度調(diào)整至每毫升100萬(wàn)細(xì)胞。

2. 將細(xì)胞分裝至冷凍管中，例如每管1ml，并將冷凍管轉(zhuǎn)移到冷凍容器中。確保通過(guò)持續(xù)重懸保持細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)。

3. 迅速將冷凍容器放入-80℃冰箱中，至少保存4小時(shí)，最多保存1周。

4. 將冷凍管從冷凍容器轉(zhuǎn)移到-150℃冰箱或液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

備注：對(duì)于1.8ml的冷凍管，每管分裝1ml細(xì)胞懸浮液。對(duì)于其他尺寸的冷凍管，務(wù)必確保分裝的體積小于最大容量，因?yàn)橐后w在冷凍過(guò)程中會(huì)膨脹。

3. 脾細(xì)胞（Splenocytes）解凍

開(kāi)始之前，將水浴加熱至37℃。提前將用于第2步的細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)熱。在后續(xù)的洗滌步驟中使用的培養(yǎng)基保持室溫即可。

自備材料：細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 10%胎牛血清（FCS）、10 mM HEPES、100 ug/mL青霉素+100 ug/mL鏈霉素；37℃水浴；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無(wú)菌；吸管和移液器；動(dòng)移液器和無(wú)菌吸頭；室溫離心機(jī)；37℃、5% CO?培養(yǎng)箱

脾細(xì)胞解凍步驟：

1. 迅速將細(xì)胞凍存管從冷凍保存處轉(zhuǎn)移到37℃水浴中解凍細(xì)胞，直到僅剩小冰晶。 **提示！** 如果您打算解凍多個(gè)冷凍管，每次只取幾個(gè)。冷凍培養(yǎng)基中含有DMSO，DMSO對(duì)細(xì)胞有毒，因此請(qǐng)盡快進(jìn)行第2步。

2. 慢慢向冷凍管中加入0.5-1ml細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞從冷凍管轉(zhuǎn)移到15ml管中。用1ml細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗冷凍管，并將其轉(zhuǎn)移到15ml管中。用細(xì)胞培養(yǎng)基將管子加滿。

3. 以300×g的速度離心10分鐘。

4. 棄去上清液，輕敲管子使沉淀變得不那么緊密。通過(guò)緩慢上下吸打，用1ml細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。加入細(xì)胞培養(yǎng)基，使總體積達(dá)到15ml。

5. 以300×g的速度離心10分鐘。

6. 棄去上清液，用1ml細(xì)胞培養(yǎng)基重懸沉淀。

7. 將細(xì)胞放入CO?培養(yǎng)箱中放置1小時(shí)。將蓋子稍微打開(kāi)。**提示！** 利用這一個(gè)小時(shí)的空閑時(shí)間來(lái)清洗和封閉你的ELISpot/FluoroSpot板。  

8. 孵育（細(xì)胞靜置）后，重懸細(xì)胞并讓任何聚集的細(xì)胞碎片沉淀（大約需要1分鐘）。然后小心地將細(xì)胞懸浮液（不包括碎片）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的15ml管中。  

每個(gè)15ml管最多加入兩個(gè)冷凍管的細(xì)胞（或大約3000萬(wàn)到4000萬(wàn)細(xì)胞）。  

9. 計(jì)數(shù)細(xì)胞并確定細(xì)胞活性。可以使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或通過(guò)顯微鏡使用臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。因?yàn)橹挥谢罴?xì)胞才能分泌分析物，所以在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)務(wù)必排除死細(xì)胞，如果可能的話，還要排除凋亡細(xì)胞。如果細(xì)胞濃度低于所需濃度，再次離心細(xì)胞，重懸并稀釋至正確的體積。

脾細(xì)胞制備好后，即可準(zhǔn)備進(jìn)行ELISpot實(shí)驗(yàn)。Mabtech作為ELISpot領(lǐng)域研究專家，可提供高品質(zhì)小鼠和大鼠ELISpot試劑盒：

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