UbiTest緩沖液：高特異性泛素化檢測的關鍵

泛素蛋白酶體系統（UPS）是一種高度調控的機制，通過蛋白質的泛素化和降解來控制許多細胞過程。泛素通過其C末端與目標蛋白上的賴氨酸殘基結合，可以以單體形式或聚合鏈形式存在。泛素鏈可以通過泛素的第一個甲硫氨酸（M1）形成線性鏈，也可以通過其七個賴氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）形成特定賴氨酸鏈。K48和K63連接的泛素鏈是細胞中最為主要的多泛素化形式。

泛素化是一個可逆的過程，去泛素化酶（DUBs）可以去除目標蛋白上的泛素，從而拯救它們免于蛋白酶體降解。確定目標蛋白上的多泛素化程度和類型對于理解它們在正常細胞過程以及與UPS相關疾病狀態中的泛素介導調控至關重要。傳統上，這些過程是通過質譜分析或使用抗泛素抗體進行免疫沉淀后，再進行免疫印跡來監測的。然而，在免疫印跡步驟中，由于表位掩蓋、親和力降低或蛋白質多泛素化導致的選擇性變化，底物抗體常常與底物的多泛素化形式產生不同的相互作用。

圖1：UbiTest檢測的示意圖：通過磁性TUBEs捕獲富集泛素化蛋白，然后從TUBEs中洗脫。分離的多泛素化洗脫液被分成兩部分：一部分保持未處理狀態，而第二部分用廣譜去泛素化酶（DUB）消化以去除泛素鏈。兩部分均使用針對目標蛋白（POI）的抗體進行免疫印跡分析。從多泛素化POI上去除泛素鏈后，在免疫印跡中可以看到一個單一的、未修飾的POI條帶。

一種更明確的證明蛋白質泛素化的方法是，在免疫印跡分析之前，將免疫沉淀與使用廣譜去泛素化酶（DUB）進行去泛素化相結合。如果在經過DUB處理后，目標蛋白（POI）的信號增強，這表明該蛋白即使在未處理的樣本中沒有明顯的反應性，也已經發生了泛素化。

LifeSensors的UbiTest檢測利用TUBEs（串聯泛素結合實體）來捕獲多泛素化蛋白，以避免由于POI免疫反應性變化而可能出現的問題。TUBEs是經過工程改造的串聯泛素結合結構域，其與多泛素的解離常數在納摩爾范圍內。LifeSensors的泛選擇性TUBEs已被證明能夠結合所有八種泛素連接類型。

為了確定目標蛋白上多泛素化的連接類型，LifeSensors開發了一種更具針對性的方法，該方法在免疫印跡分析之前使用特定連接類型的DUB。如果在經過K48/K63特異性DUB處理后，與未修飾POI對應的條帶信號增強，則表明該蛋白發生了K48/K63多泛素化。

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