文獻(xiàn)解析：偶聯(lián)位點(diǎn)和技術(shù)對抗體-藥物偶聯(lián)物穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)的影響

文章標(biāo)題： Effect of Conjugation Site and Technique on the Stability and Pharmacokinetics of Antibody-Drug Conjugates

文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.xphs.2021.08.002

研究背景：

ADCs結(jié)合了傳統(tǒng)治療性抗體的特異性和高毒性化療藥物的毒性，已成為一種有前景的抗癌治療手段。評估不同偶聯(lián)位點(diǎn)和偶聯(lián)技術(shù)對ADCs穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)（PK）的影響。研究比較了將藥物偶聯(lián)到抗體的半胱氨酸殘基（如S239、L328等）和通過微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（mTG）偶聯(lián)到天然抗體位置（如Q295）或識(shí)別基序（如LC和HC C-末端）的效果，包括基因工程半胱氨酸技術(shù)和基于mTG的酶促偶聯(lián)方法。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法：

使用重組表達(dá)的抗體，通過不同的偶聯(lián)方法生成DAR（藥物-抗體比）為2的ADCs。通過疏水相互作用色譜（HIC）、納米差示掃描熒光法（nanoDSF）、生物層干涉法（BLI）等評估ADCs的疏水性、熱穩(wěn)定性和與FcRn的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因Tg276小鼠中進(jìn)行PK研究，評估ADCs的總抗體濃度和結(jié)合藥物的穩(wěn)定性。使用半胱氨酸工程化技術(shù)在特定位點(diǎn)引入半胱氨酸，并通過馬來酰亞胺功能化的連接子-載荷（如MC-VC-PAB-MMAE）進(jìn)行特異性結(jié)合。利用mTG酶催化在Q295位或融合至輕鏈（LC）和重鏈（HC）C末端的特定肽基序進(jìn)行結(jié)合。 通過多種體外分析（如疏水相互作用色譜、熱穩(wěn)定性、FcRn結(jié)合、血清穩(wěn)定性）評估ADCs的特性。

研究結(jié)果：

不同偶聯(lián)位點(diǎn)對ADC的穩(wěn)定性有顯著影響，特別是在體內(nèi)循環(huán)中的穩(wěn)定性。例如，HC C-末端偶聯(lián)的ADC在體內(nèi)表現(xiàn)出較高的藥物釋放率。偶聯(lián)到CH2結(jié)構(gòu)域或LC C-末端的ADCs熱穩(wěn)定性有所下降，但不影響總體PK行為。mTG偶聯(lián)到Q295或LC C-末端的ADCs表現(xiàn)出優(yōu)異的PK行為，而半胱氨酸偶聯(lián)的ADCs中，L328位點(diǎn)與已建立的S239位點(diǎn)相當(dāng)。

模型驗(yàn)證與應(yīng)用：

Tg276小鼠模型：驗(yàn)證了其在預(yù)測ADCs PK行為方面的適用性，尤其是能夠檢測到不同偶聯(lián)位點(diǎn)引起的微妙差異。

抗體支架影響：研究發(fā)現(xiàn)，不同的抗體支架對ADC的PK行為也有顯著影響，強(qiáng)調(diào)了選擇適合的抗體和偶聯(lián)位點(diǎn)的重要性。

結(jié)論與展望：

系統(tǒng)比較了不同偶聯(lián)位點(diǎn)和技術(shù)對ADC穩(wěn)定性和PK的影響，確定了L328和LC C-末端分別為半胱氨酸偶聯(lián)和mTG偶聯(lián)的優(yōu)選位點(diǎn)。未來研究應(yīng)進(jìn)一步探索不同ADC組件之間的復(fù)雜相互作用，以優(yōu)化ADC的設(shè)計(jì)和開發(fā)。

實(shí)際應(yīng)用與意義：

對ADC藥物的研發(fā)具有重要意義，為選擇最佳偶聯(lián)位點(diǎn)和技術(shù)提供了科學(xué)依據(jù)，有助于提高ADC藥物的療效和安全性。此研究通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和全面的評估方法，為ADC藥物的優(yōu)化提供了寶貴的數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

Andracon–Recombinant Microbial Transglutaminase（#T300）在文章中的作用：

酶催化結(jié)合：Andracon?（或類似的重組微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶mTG）在本文中作為關(guān)鍵酶工具，用于催化ADC中抗體與載荷的連接。mTG能夠在抗體上的谷氨酰胺殘基和連接子上的酰基受體之間形成穩(wěn)定的異肽鍵。

結(jié)合位點(diǎn)特異性：mTG允許通過融合特定肽基序（如LLQG或GGLLQGPP）至抗體的LC或HC C末端，或在抗體去糖基化后結(jié)合至內(nèi)源性Q295位，從而實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性結(jié)合。

穩(wěn)定性和PK優(yōu)勢：研究表明，通過mTG結(jié)合至Q295位或LC C末端的ADCs在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和優(yōu)異的PK行為。這證明了mTG在ADC制備中的潛在優(yōu)勢。

酶工程：文中還提到了利用工程化mTG變體來允許在全糖基化抗體上進(jìn)行Q295位的結(jié)合，進(jìn)一步展示了mTG在ADC制備中的靈活性和潛力。

綜上所述，Andracon?（或重組mTG）在本文中作為重要的酶催化工具，為ADC的結(jié)合提供了一種位點(diǎn)特異、高效且穩(wěn)定的方法，顯著影響了ADC的穩(wěn)定性和PK特性。