冠狀病毒超家族（Coronaviridae）包括幾類具有大RNA編碼基因組的人類病原體，例如流感，普通感冒和病毒性腦炎，它們被分為α，β和γ冠狀病毒家族，并進(jìn)一步分為A，B ，和C型別。COVID-19被歸類為與SARS-CoV高度相似的B型冠狀病毒，因此，它最近更名為SARS-CoV-2。盡管人們在1960年才記錄了β冠狀病毒家族的第一批成員，但該家族中新增的人類強(qiáng)致病性病原體數(shù)量在過去20年中迅速增加，目前已達(dá)到6個(gè)，最新的有SARS（嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥，2002年），MERS（中東呼吸系統(tǒng)綜合癥，2012年），以及目前正在流行的COVID-19 / SARS-CoV-2。

      在這里，我們一起來了解一下病毒“生命”周期與細(xì)胞骨架的相互作用的四個(gè)階段：

       第一階段：病毒入侵

      冠狀病毒感染的第一階段是Spike（S）蛋白質(zhì)介導(dǎo)的通過Spike（S）蛋白質(zhì)附著到細(xì)胞表面的神經(jīng)酰胺酸部分（具有9個(gè)碳原子的酸性碳水化合物）或硫酸乙酰肝素。這種感染策略非常有效，因?yàn)樵谒胁溉閯?dòng)物細(xì)胞表面上存在許多類型的受體分子，從而為質(zhì)膜附著創(chuàng)造了豐富的條件。結(jié)合后，病毒顆粒通過調(diào)節(jié)FAK / Cofilin / Rac / Cdc42途徑主動(dòng)重新排列細(xì)胞骨架。

      呂等人在體外對小鼠腦神經(jīng)元（N2a）細(xì)胞進(jìn)行冠狀病毒PHEV給藥后，顯示出絲狀偽足，片狀脂質(zhì)體和應(yīng)激纖維比例隨著時(shí)間波動(dòng)。在5min內(nèi)，應(yīng)激纖維被消耗殆盡，而絲狀偽足占主導(dǎo)，占總鬼筆環(huán)肽熒光信號的80％。在20-40min之間，lameopodia與絲狀偽足平分秋色，最終在60min時(shí)，比例恢復(fù)到接近正常水平，即60％的信號是應(yīng)激纖維。盡管這是從宏觀角度進(jìn)行觀察，但這在納米尺度上表明病毒體可能會創(chuàng)建一個(gè)調(diào)節(jié)其自身進(jìn)入的局部環(huán)境。在另一份研究報(bào)告中，Owczarek等人對人類大腸腺癌細(xì)胞（HCT-8）進(jìn)行冠狀病毒OC43給藥來研究內(nèi)陷法，膀胱切除術(shù)對F-Actin功能影響。Milewska等人也描述了類似的病毒入侵研究，通過其他機(jī)制，例如小窩依賴的內(nèi)陷或胞飲作用，病毒感染率取決于細(xì)胞表面的病毒載量。細(xì)胞入侵過程中也會將病毒體包被在靠近細(xì)胞核的囊泡中。

      冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞-復(fù)制-組裝-釋放的示意圖（改編自Simpson和Yamauchi，2020）

      用PHEV冠狀病毒處理或未處理的HCT-8細(xì)胞5min，固定細(xì)胞并用Acti-stain 488（綠色，細(xì)胞骨架），抗PHEV外殼蛋白（紅色）和DNA（藍(lán)色，Hoescht）染色。B圖：感染冠狀病毒，A圖：未感染。

      Note：感染樣本中細(xì)胞外圍的染色水平很高，表明有片狀脂膜病和絲狀偽足（窄峰）。與未感染的細(xì)胞樣本相比，這表明細(xì)胞質(zhì)染色顏色深，表明有應(yīng)激纖維。（上圖由He Wenqi教授提供，來自Lv et al.2019）。

       第二階段：轉(zhuǎn)運(yùn)

      在第二階段，一些研究揭示了肌動(dòng)蛋白和微管蛋白都是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的互補(bǔ)細(xì)胞骨架成分。Owczarek等人探討了F-Actin在細(xì)胞內(nèi)定位中的功能，jasplakinolide（一種細(xì)胞可滲透的F-肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定化合物）抑制了病毒入侵過程中病毒顆粒的質(zhì)膜結(jié)合，而cytochalsin D（一種F-actin的解聚化合物）并沒有抑制病毒的入侵，但擾亂了病毒體從周圍核到細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的正常定位。冠狀病毒刺突蛋白C末端肽（S蛋白）以冠狀病毒株特異性方式與幾種β-tubulin亞型結(jié)合，混亂的肽顯示結(jié)合不是由于隨機(jī)的離子電荷相互作用。因此，病毒體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)是利用多種細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白來進(jìn)行導(dǎo)航并定位到細(xì)胞內(nèi)的特定區(qū)域的。

       第三階段：組裝和成熟

      病毒體被轉(zhuǎn)運(yùn)到核周區(qū)域后，冠狀病毒RNA從囊泡和病毒粒子中滲出，進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。DNA復(fù)制子隨后被轉(zhuǎn)錄稱RNA，并從細(xì)胞核進(jìn)入高爾基體/ ER /微管組織中心。最初，核衣殼（N）蛋白與RNA拷貝結(jié)合并與囊泡膜結(jié)合，然后N和E蛋白進(jìn)一步成熟，這是組裝基本病毒樣顆粒（VLP）所需的。如果Spike（S）蛋白是共表達(dá)的，則它會摻入病毒顆粒中。在多種細(xì)胞骨架和膜調(diào)節(jié)蛋白協(xié)同作用下（例如HDAC6，泛素和Rab GTPases）通過濃縮包裝組分來輔助組裝。

       第四階段：釋放

      冠狀病毒核衣殼或棘突蛋白與GFP的遺傳融合使得可以通過熒光顯微鏡跟蹤非感染性病毒顆粒。Siu等使用這種技術(shù)監(jiān)測SARS-CoV釋放，發(fā)現(xiàn)了融合成多顆粒團(tuán)塊的囊泡。該轉(zhuǎn)運(yùn)對布雷菲德菌素A敏感，表明正在利用分泌途徑。其他研究發(fā)現(xiàn)諾考達(dá)唑可有效抑制病毒體向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，表明微管是病毒釋放出口的重要組成部分。Rab11涉及到KHC綁定以進(jìn)行微管運(yùn)輸，然后與肌球蛋白結(jié)合，以幫助橫穿眼周肌動(dòng)蛋白基質(zhì)并從細(xì)胞中釋放出來。

       小結(jié)：

      總的來說，冠狀病毒通過質(zhì)膜附著和內(nèi)陷進(jìn)入細(xì)胞的方式有很多種，隨后，肌動(dòng)蛋白，微管蛋白及其化學(xué)機(jī)械動(dòng)力中的動(dòng)力蛋白，動(dòng)力蛋白和肌球蛋白細(xì)胞骨架成分都需要進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到正確的位置進(jìn)行復(fù)制。逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后，將正鏈RNA包裝在高爾基體/ ER /微管復(fù)合體的支架上。囊泡包裹的病毒粒子沿著微管移動(dòng)，然后與質(zhì)膜融合并逃出細(xì)胞。冠狀病毒研究中的許多方法都使用試劑，在這里我們?yōu)槟扑]熒光鬼筆環(huán)肽，微管和肌動(dòng)蛋白抑制試劑盒，動(dòng)力蛋白，驅(qū)動(dòng)蛋白，以及各類小G蛋白（Rac，Cdc42）活化測定研究工具。

      冠狀病毒研究中有許多未解決的問題。例如，病毒體是如何通過質(zhì)膜相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架以協(xié)調(diào)其進(jìn)入？單個(gè)病毒體可以自己進(jìn)入細(xì)胞嗎？將肌動(dòng)蛋白和微管細(xì)胞骨架用于不同功能的意義何在？與流行性感冒和普通感冒相比，這種病毒為何能躲避免疫系統(tǒng)追蹤這么久？這些問題的解答無疑將在將來給我們帶來更多的認(rèn)知和可能的藥理學(xué)突破。

      G-LISA 活化檢測試劑盒：

       鬼筆環(huán)肽：

       Actin生化試劑盒：

      Tubulin生化試劑盒：

      參考文獻(xiàn)：

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