精子質(zhì)量檢測是診斷男性不育的重要手段，精液的常規(guī)分析費時費力，檢測指標(biāo)單一，只能反映精子的形態(tài)特征和有限的功能，無法準(zhǔn)確且全面的反映精子質(zhì)量。

       流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是在細(xì)胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。將FCM用于精液檢查，可把定性的描述過渡到定量的研究，并可進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，大大提高了實驗結(jié)果的科學(xué)性，而且可對精液進(jìn)行高通量、多參數(shù)分析，能極大的拓展精子學(xué)這個生殖方面的子領(lǐng)域。

      流式細(xì)胞術(shù)研究專家EXBIO可提供流式細(xì)胞術(shù)精液檢測分析試劑盒，從精液的多參數(shù)角度評估精子的質(zhì)量：

      基于該試劑盒，各指標(biāo)參數(shù)的處理與分析如下：

    （一）精液中精子及白細(xì)胞計數(shù)

      白細(xì)胞是精液中常見的一種細(xì)胞。白細(xì)胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生活性氧，分泌一些細(xì)胞因子等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致精子數(shù)量減少。研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞計數(shù)增高與精子參數(shù)(包括密度)的降低存在明顯相關(guān)性。FCM檢測是根據(jù)白細(xì)胞所表達(dá)的共同抗原，用結(jié)合熒光染料的單克隆抗體CD45標(biāo)記白細(xì)胞進(jìn)行檢測，相比于直接鏡檢、過氧化物酶染色等其他檢測手段，F(xiàn)CM可準(zhǔn)確區(qū)分白細(xì)胞與生精細(xì)胞，操作簡便，結(jié)果可靠，且可進(jìn)一步區(qū)分白細(xì)胞各亞群。

      操作步驟：

      1.吸取50ul稀釋好的精液至試管中

      2.加10ul CD45 PE-Cy5抗體溶液

      3.混合樣品，在室溫下孵育20分鐘

      4.加50ul熒光計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)液（首先，將標(biāo)準(zhǔn)液混合均勻，加幾滴到干凈的微管中，然后用移液器從微管中吸取精準(zhǔn)體積的標(biāo)準(zhǔn)液加到精子樣本管）

      5.加5ml PBS，混合后上流式細(xì)胞儀

      使用以下公式進(jìn)行精子和白細(xì)胞的計數(shù):

      S：精液中的精子數(shù)

      L：精液中的白細(xì)胞數(shù)

      Gate B: B門中的event count值

      Gate C: C門中的event count值

      Gate D: D門中的event count值

    （二）精子存活率

      PI (碘化丙啶, Propidium Iodide)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色，只有沒有活力的精子才會被碘化丙啶溶液染色。因此用FCM結(jié)合DNA熒光染料PI，可以反映出精子的存活率。

操作步驟：

     1.吸取50ul稀釋好的精液至試管中

     2.加10ul PI溶液

     3.混合均勻，在室溫下孵育20分鐘

     4.加0.5mlPBS，混合后上流式細(xì)胞儀

      結(jié)果

      將測量數(shù)據(jù)可視化為前向散射（FSC）與側(cè)向散射（SSC）點圖。 如圖3所示，在精子細(xì)胞周圍設(shè)門。然后在直方圖中可視化精子細(xì)胞（圖4），其中X軸表示PE-Cy5或PerCP通道中碘化丙啶的熒光強(qiáng)度。使用適當(dāng)?shù)拈T分離陽性和陰性精子細(xì)胞。 陰性群體代表有活力的精子，而PI陽性群體則代表無活力的精子。 精子的生存率由所有精子細(xì)胞中有活力的精子的百分比表示。

    （三）頂體完整性和頂端體蛋白的存在

      在受精過程中，哺乳動物剛射出的精子在體內(nèi)要經(jīng)過獲能和頂體反應(yīng)，才能穿入卵細(xì)胞并與其融合，完成受精。因此檢測精子的頂體狀態(tài)，有助于反映精子的受精能力。精子頂端體蛋白（intra-acrosomal protein），是一種在成熟精子的頂體膜上特異性表達(dá)的蛋白，該蛋白在幾乎所有人類精子樣本中都能被檢測到，且表達(dá)量穩(wěn)定。利用標(biāo)記了FITC熒光素的頂端體蛋白抗體，特異性地標(biāo)記在頂體膜上，其熒光強(qiáng)度可反映頂體大小，因此通過測定熒光強(qiáng)度可間接反映頂體結(jié)構(gòu)的完整性。

     操作步驟-頂體的完整性

     1.吸取50ul稀釋好的精液至試管中

     2.加1 ml PBS，混合后，150 g離心5分鐘，去上清

     3.再洗一次（重復(fù)步驟2）

     4.向沉淀中加10ul Intra-acrosomal protein  FITC抗體

     5.混合均勻，在室溫下孵育20分鐘

     6.加0.5mlPBS，混合后上流式細(xì)胞儀

      操作步驟-是否存在Intra-acrosomal protein（需透化）

     1.吸取50ul稀釋好的精液至試管中

     2.加1 ml滲透液

     3.混合均勻，室溫下孵育15分鐘

     4.150 g離心5分鐘，去上清液

     5.向沉淀物中加入1 ml PBS，混合均勻，以150 g離心5分鐘

     6.再洗一次（重復(fù)步驟5）

     7.加入10 ul Intra-acrosomal protein  FITC抗體

     8.充分混勻，室溫下孵育20分鐘

     9.加5mlPBS，混合后上流式細(xì)胞儀

     結(jié)果

     可視化抗體（頂端體蛋白FITC）對可滲透和未滲透樣品染色的前向散射（FSC）與側(cè)向散射（SSC）點圖，并在精子周圍設(shè)門，如圖3所示。然后在直方圖中可視化精子事件（見圖5-7），其中X軸表示熒光強(qiáng)度 在FITC熒光檢測器中。 使用適當(dāng)?shù)拈T將陽性和陰性精子分開。 圖5顯示了陽性精子含量低（<30％）的未透化非病理性精子事件。 陰性代表具有完整頂體的精子，陽性代表具有受損的頂體的精子。圖6顯示了滲透性非病理性精子，其中陽性精子占主導(dǎo)地位。 陽性精子表明存在頂端體蛋白。圖7顯示了未滲透的病理性精子，其中頂體受損的陽性精子的含量高（> 30％）。

     EXBIO是捷克一家著名的生物試劑公司，專注于流式細(xì)胞術(shù)配套試劑的開發(fā)。自1990年成立以來，EXBIO公司研發(fā)和制造的抗體分銷全球。目前，EXBIO可提供超過4000種質(zhì)優(yōu)、價廉的研究和臨床應(yīng)用抗體，涵蓋了血液學(xué)，免疫學(xué)，癌癥，干細(xì)胞和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域，如：CD分子、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞骨架、凋亡、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、腫瘤標(biāo)志物、人血型、HLA、生殖等研究用抗體，涉及熒光染料如FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7、APC、PerCP、PerCP-Cy5.5、Pacific Blue、Pacific Orange、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、Biotin等多達(dá)13種，滿足客戶各類實驗需求。

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     作為一家具有高端的技術(shù)實力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷高新技術(shù)開發(fā)區(qū)，服務(wù)面向全國。艾美捷科技是集進(jìn)口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，為用戶提供專業(yè)的前沿資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務(wù)。為了更好的服務(wù)客戶，公司組建了一支經(jīng)驗豐富的研發(fā)團(tuán)隊-艾美捷生物技術(shù)中心，進(jìn)入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國內(nèi)生物領(lǐng)域的同仁們!

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