從1993年發(fā)現(xiàn)miRNA開始，有關(guān)miRNA的探索與發(fā)現(xiàn)就沒有停止過。miRNA雖只有很短的一段核苷酸，卻通過調(diào)控大量的靶基因，在基因表達中扮演了重要角色。小身體，大能量，說的就是它——microRNA（簡稱miRNA）。

      miRNAs是一類長約20nt~24nt長度的單鏈小RNA，由細胞內(nèi)源產(chǎn)生的發(fā)卡（hairpin）結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本加工而來。miRNAs的加工成熟是一個經(jīng)歷了細胞核到細胞質(zhì)空間轉(zhuǎn)變、多種酶和輔助蛋白協(xié)調(diào)完成的受到多層次調(diào)節(jié)的多步驟精密反應(yīng)：1）DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄形成初級產(chǎn)物pri-miRNA；2）pri-miRNA在核內(nèi)經(jīng)Drosha酶剪切形成miRNA前體pre-miRNA；3）pre-miRNA轉(zhuǎn)運至胞漿，經(jīng)Dicer酶剪切形成成熟的miRNA。miRNA的功能主要是沉默靶基因表達：在RISC沉默復(fù)合體協(xié)助下，miRNA與其靶基因mRNA的3'-UTR（3'端的非翻譯區(qū)）結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)mRNA降解，從而抑制蛋白翻譯。

       因為miRNA的長度比較短，因此用常規(guī)的qPCR法很難對其直接定量。所以，在針對miRNA的PCR技術(shù)中，必須要延長待測miRNA的長度，構(gòu)建出一個足夠長的PCR模板，才能進一步應(yīng)用PCR技術(shù)來定量分析。現(xiàn)在常用的對miRNA的定量方法主要有兩種，分別為莖環(huán)引物法、加尾法。

        頸環(huán)引物法

      需要自己設(shè)計一種特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，一般長度約為45bp。整個莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄引物由兩個部分組成：①通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，自身形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)不僅能夠有效地延長miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度，同時它自身互補的構(gòu)象可以避免與其他同源基因結(jié)合，減少了非特異性擴增的幾率。② 5~8個與目的miRNA的3’端反向互補的堿基。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物與miRNA 分子的3’端結(jié)合，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行反應(yīng)，獲得人為加長的miRNA第一鏈cDNA。

      莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法利用可以正確折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物對miRNA進行反轉(zhuǎn)錄，以獲得人為加長后的miRNA cDNA第一鏈，然后利用合適的退火溫度將反轉(zhuǎn)錄引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開并與PCR擴增的正反向引物結(jié)合，再通過染料法或探針法進行熒光定量PCR檢測。這種方法的特異性較高，但是對引物的要求也很高，需要引物在反轉(zhuǎn)錄階段形成莖環(huán)式的正確構(gòu)型，因此設(shè)計起來較為繁瑣和困難。而且針對同一樣本中不同的目的miRNA，就需要配制不同的逆轉(zhuǎn)錄體系。所以這種方法比較適合對樣本中少量幾個miRNA的精確定量檢測。

         加尾法

      加尾反轉(zhuǎn)錄法利用poly(A)聚合酶為成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用5’端帶通用標(biāo)簽的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，獲得人為加長的miRNA cDNA第一鏈，最后用與通用標(biāo)簽序列互補的反向引物進行染料法或者探針法的熒光定量PCR檢測。這種方法可以批量地將所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然后進行反轉(zhuǎn)錄和檢測，無需繁瑣的引物設(shè)計，因此被很多實驗室采用。

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        引物驗證結(jié)果

Figure A	Figure B

      All-in-One™ miRNA qPCR pimer經(jīng)驗證產(chǎn)生單一擴增產(chǎn)物，融解曲線均呈單一銳鋒，電泳條帶均呈單一條帶，且與目標(biāo)miRNA相符。由10種人組織混合樣本的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA作為引物驗證的模板。qPCR反應(yīng)由終濃度0.2 µM的引物和All-in-One™ qPCR Mix配合完成。（A）驗證結(jié)果的擴增曲線，（B）驗證結(jié)果的熔解曲線。

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