miRNA是許多人類病理學(xué)中有潛力的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，如何準(zhǔn)確對(duì)miRNA進(jìn)行定量呢？前期我們介紹了免疫法定量miRNA的試劑盒，今天介紹常規(guī)基于PCR法的miRNA定量的試劑盒——雙尾RT-qPCR。

傳統(tǒng)microRNA PCR檢測方法的痛點(diǎn)：用傳統(tǒng)的PCR法檢測microRNA的挑戰(zhàn)在于，兩個(gè)常規(guī)PCR引物的總長度幾乎是microRNA長度的兩倍，因此不適合于做miRNA的引物。以前的技術(shù)通過使用發(fā)夾引物延伸microRNA，添加poly A尾巴或通過連接添加片段來解決這個(gè)問題，但是這會(huì)降低檢測的靈敏度和特異性。此外，這些方法無法檢測在3'末端修飾的microRNA，因?yàn)樗鼤?huì)干擾延伸過程。

市面上常見的miRNA定量檢測試劑盒原理

BioVendor專利產(chǎn)品——雙尾RT-qPCR

我們專利的雙尾RT-qPCR技術(shù)，具有獨(dú)特的RT引物機(jī)制，與其他方法相比，可提供出色的靈敏度和特異性。雙尾RT-qPCR技術(shù)已被開發(fā)用于總的miRNA和piRNA的定量。

雙尾RT-qPCR原理：與使用單個(gè)結(jié)合探針不同，雙尾PCR使用兩個(gè)半探針，它們分別結(jié)合到不同的microRNA片段上，這些片段通過折疊的系鏈連接。雖然每個(gè)半探針本身都很短, 無法結(jié)合到microRNA上，但當(dāng)兩個(gè)半探針互補(bǔ)時(shí)，它們會(huì)協(xié)同結(jié)合，這種結(jié)合的特異性是非常高的，因?yàn)樵诙贪胩结樦绣e(cuò)配的影響非常大。然后可以使用兩個(gè)特定序列引物對(duì)形成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用SYBR進(jìn)行檢測。

雙尾RT-qPCR優(yōu)勢：

• 高靈敏度（最多少于10個(gè)分子）

• 高特異性

• 適合于多種樣本（血漿/血清，血液，組織等）中的miRNA檢測和定量

• 通過折疊的系鏈連接的兩個(gè)半探針（結(jié)合不同的microRNA片段）

• 動(dòng)態(tài)范圍廣（高達(dá)9 log）

• 在進(jìn)行單重qPCR之前，可進(jìn)行雙管多重RT-PCR

• 提供定制化服務(wù)

1.高靈敏度及特異性：

• 5?互補(bǔ)片段顯著提高分析的靈敏度：

• 5? 互補(bǔ)片段顯著提高檢測的特異性：

5′-hemiprobe的特異性及靈敏度驗(yàn)證：為了測試5′-hemiprobe對(duì)特異性的貢獻(xiàn)，我們比較了兩種雙尾RT引物區(qū)分Let-7 miRNA家族的兩個(gè)成員：Let-7a和Let-7f的能力，它們僅有位于miRNA序列中心的單個(gè)核苷酸的差異。RT 1引物的5'-hemiprobe設(shè)計(jì)成與let-7a的5'-末端的前十個(gè)核苷酸結(jié)合， 而RT 2引物的5'-hemiprobe結(jié)合在let-7a的8個(gè)核苷酸上，通過這種設(shè)計(jì)，區(qū)分let-7a和let-7f的核苷酸只是由RT 2引物的5′-hemiprobe檢測的，而不是由RT 1引物檢測的。RT 2引物的5′-hemiprobe也很短（8個(gè)核苷酸），因?yàn)槲覀冋J(rèn)為探針序列較短時(shí)錯(cuò)配的影響會(huì)更加明顯。其余的RT 1和RT 2引物序列以及所用的PCR引物是完全相同的。使用RT 2引物時(shí)，完全匹配和錯(cuò)配的模板之間的ΔCq（ΔCq= 11.07）顯著大于使用RT 1引物（ΔCq = 4.66），不帶有5′-hemiprobe的不同堿基重疊的RT 2引物，而不是不帶有RT 1引物的RT 2引物。這證明了5'-半探針對(duì)系統(tǒng)特異性的重大貢獻(xiàn)。值得注意的是，兩種雙尾RT引物完全互補(bǔ)的let-7a microRNA的Cq值相等，表明即使5′-hemiprobe的長度有兩個(gè)堿基的不同，檢測靈敏度仍然相同。

2.適用樣本類型豐富：

3.miRNA定量的試劑盒檢測流程簡便：

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