進(jìn)行 ELISA 前制備樣品的提示

請參閱隨試劑盒提供的實驗方案，了解有關(guān)樣品制備和相容性樣品類型的產(chǎn)品特定詳細(xì)信息。

這些指南旨在作為教育資源用于制備 ELISA 測定法中用到的常規(guī)試樣。根據(jù)靶標(biāo)和需要檢測內(nèi)容的不同，樣品的制備過程可以進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)構(gòu)建新的測定法時，查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得與您實驗類似的實驗實例通常是較好的做法。

樣品制備方法

細(xì)胞培養(yǎng)物上清液

—將細(xì)胞培養(yǎng)基移至離心管，并在 4°C 下以 1,500 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

細(xì)胞提取物

—將組織培養(yǎng)板放置在冰上。

—吸出培養(yǎng)基并且用冰冷的 PBS 輕輕洗滌細(xì)胞一次。

—吸出 PBS 并且每 100 mm 培養(yǎng)板添加 0.5 mL 完全提取緩沖液。

—剝離細(xì)胞，收集在傾斜板中，然后移至預(yù)冷管中。

—短暫渦旋并在冰上孵育 15-30 分鐘。—在 4°C 下以 13,000 rpm 離心 10 分鐘，沉淀不溶性內(nèi)容物。

—將上清液（這里是指可溶性細(xì)胞提取物）分裝至冰上干凈的冷卻管，然后在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

條件培養(yǎng)基

—將細(xì)胞接種到完全（含血清）生長培養(yǎng)基中，使細(xì)胞增殖到所需覆蓋度。

—棄去生長培養(yǎng)基并用幾毫升溫?zé)?PBS 小心洗滌。重復(fù)洗滌步驟。

—棄去最后的 PBS 洗滌液并小心添加無血清生長培養(yǎng)基。

—孵育 1-2 天。—將培養(yǎng)基移至離心管，并在 4°C 下以 1,500 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

乳汁

—收集樣品并在 4°C 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

—分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。血漿—將全血收集到含抗凝血劑的管中或添加 0.1 M 檸檬酸鈉至 1/10 終體積。

—在 4°C 下以 3,000 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液（血漿）并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

尿液

—收集樣品并在 4°C 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

—分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

唾液

—收集樣品并在 4°C 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

—分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

血清

—將全血收集到未經(jīng)處理的試管中，比如是不含抗凝血劑的試管。

—在室溫下靜止孵育 20 分鐘。

—在 4°C 下以 3,000 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液（血清）并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

組織提取物

—用干凈的工具切割所關(guān)注的組織，最好在冰上進(jìn)行，并應(yīng)盡可能快以防止被蛋白酶降解。

—將組織置于圓底的微量離心管中，并浸入液氮中進(jìn)行速凍。將樣品保存在 -80°C 下以便后續(xù)使用或放置在冰上進(jìn)行直接勻漿。

—對于約 5 mg 的一片組織，需要向管中添加約 300 μL 完全提取緩沖液（查看細(xì)胞/組織提取緩沖液配方），然后用電動勻漿器勻漿。—清洗刀片兩次，每次清洗使用 300 μL 完全提取緩沖液，然后在 4°C 下維持恒定振動 2 小時（例如置于冷室中的回旋搖床上）。

—在 4°C 下以 13,000 rpm 離心 20 分鐘。置于冰上，將上清液（這里是指可溶的蛋白質(zhì)提取物）分裝至新的冷卻管中并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)。

裂解緩沖液的體積必須根據(jù)存在的組織數(shù)量確定。最終蛋白質(zhì)提取物的典型濃度 > 1 mg/mL。

細(xì)胞/組織提取緩沖液配方 

–100 mM Tris，pH 7.4 

–150 mM NaCl 

–1 mM EGTA 

–1 mM EDTA 

–1% Triton X-100 

–0.5% 脫氧膽酸鈉

制備完全提取緩沖液所需的其它試劑。

—磷酸酶抑制劑混合物—蛋白酶抑制劑混合物 

–PMSF

在使用前才根據(jù)生產(chǎn)商的說明來添加磷酸酶和蛋白酶抑制劑的混合物到細(xì)胞提取緩沖液里面，PMSF 的終濃度為 1mM。

一般建議

—推薦的蛋白質(zhì)提取物濃度為至少 1-2 mg/mL。

—通常，用結(jié)合緩沖液將血清、血漿、細(xì)胞和組織提取物稀釋 50%。

—在融化后使用前，將樣品在 4°C 下以 10,000 rpm 離心 5 分鐘以除去任何沉淀物。