組織病理技術(shù)

組織處理：

1.取新鮮組織厚度不超過 5mm，10% 中性福爾馬林固定，大于 24 小時(shí)。

2.固定后沖水 12-24 小時(shí)，

3.75%酒精，1 次，1 小時(shí)，

4.85%酒精，1 次，1 小時(shí)，

5.95%酒精，3 次，1 小時(shí)，

6.100%酒精，3 次，1 小時(shí)，

7.二甲苯，2 次，1 小時(shí)，

8.石蠟浸泡，3 次，2 小時(shí)，

HE染色：{水化}

1.二甲苯，2 次，5-10 分鐘，

2.100%酒精，1 次，1-2分鐘，

3.95%酒精，1 次，1-2分鐘，

4.85%酒精，1 次，1-2分鐘，

5.75%酒精，1 次，1-2分鐘，

6.過蒸餾水，

{染色}

1.Mayer 氏蘇木素，1分鐘，

2.溫水沖洗，5-10 分鐘，

3.75% 鹽酸酒精， 1-2分鐘，

4.自來水沖洗，30秒鐘，

5.依紅復(fù)染，1-2分鐘，

6.自來水洗，30秒鐘，

7.85%酒精，1 次，1-2分鐘，

8.95%酒精，2 次，1-2分鐘，

9.100%酒精，2 次，1-2分鐘，

10. 二甲苯，2 次，5-10 分鐘，

11. 中性樹膠封片。

免疫組化染色

一．石蠟切片免疫組化染色實(shí)驗(yàn)步驟：

1、石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應(yīng)置 60℃ 1 小時(shí)）。

（1）二甲苯?、II,各 10 分鐘。

（2）梯度酒精：100%，2 分鐘? 95%，2 分鐘? 80%，2 分鐘? 70%2 分鐘。

（3）蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

2．過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O2，室溫 10 分鐘（避光）。

3．蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

4．抗原修復(fù)：根據(jù)待檢測(cè)的抗原，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā８剑嚎乖迯?fù)液（10mM pH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液）的配制

（1）儲(chǔ)備液的配制：

A 液：枸櫞酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水 1000ml

B 液：枸櫞酸 21g + 蒸餾水 1000ml

（2）工作液的配制：A 液 82ml + B 液 18ml + 蒸餾水 900ml

抗原修復(fù)的方法：

（1）高壓鍋處理技術(shù)：枸櫞酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0）,淹沒切片,蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸,上汽 3 分鐘后緩慢冷卻（可用自來水在高壓鍋外沖，以助冷卻）。

（2）微波處理技術(shù):用塑料切片架,置于塑料或耐溫玻璃容器內(nèi)，枸櫞酸鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或高檔,5 分鐘;取出并補(bǔ)充已預(yù)熱的枸櫞酸鈉緩沖液；再選擇中高或高檔,5 分鐘.（最佳溫度為 92?95℃）

（3）酶消化處理：此略。

抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)

（1）組織不能干。

（2）選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。

（3）該方法主要用于 10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

（4）抗原修復(fù)后至 DAB 顯色的過程中，均需用 PBS 緩沖液。

5．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

6．正常血清封閉：

從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分（保持組織呈濕潤狀態(tài)）,滴加正常山羊或兔血清（與第二抗體同源動(dòng)物血清）處理，37℃，15 分鐘。附：正常血清配制 (或按試劑盒規(guī)定的濃度配制)按 1:20 比例,用 PBS 配制,每張切片需要量按 50?l+5?l (10%拋灑量)計(jì) 算 。

7．滴加第一抗體：

用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃ 2 小時(shí)（也可置于 4℃冰箱過夜）。

8．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

9．滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。

10．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

11．滴加三抗（SAB復(fù)合物），37℃，40 分鐘。

12．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

13．DAB顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止（自來水沖終止）。附：DAB 的配制

（1）儲(chǔ)備液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分裝成 1ml,100?l,50，20l 等，—20℃，凍存。（2）工作液：DAB 儲(chǔ)備液 20?l + PBS 1000?l + 3% H2O25

14．自來水（細(xì)水）充分沖洗。

15．蘇木素復(fù)染，室溫，30 秒，自來水沖洗。

16．自來水沖洗返藍(lán)，15 分鐘。

17．梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 ? 95%，2 分鐘 ? 100%，2 次，5 分鐘。

18．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各 5 分鐘

19．封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

二．細(xì)胞爬片的免疫組化染色：

1.取出細(xì)胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20??30 分鐘。

2.蒸餾水浸泡 5 分鐘，2 次。

3.打孔液浸泡 5 分鐘。

4.蒸餾水浸泡 5 分鐘，2 次。

5.后接前述實(shí)驗(yàn)步驟的第 6 步（正常血清封閉）。

注：第 3、4 步僅用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原，檢測(cè)細(xì)胞膜抗原時(shí)不用。

三．冰凍切片的免疫組化染色：

1.新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片(也可-80℃保存),厚度為 5～6m。

2.載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風(fēng)吹干。

3.如不馬上染色，可密封后-20℃保存。

4.染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘。

5.PBS 洗 2 次,每次 5 分鐘,(必要時(shí)應(yīng)用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton 打孔)

6.3% H2o2 滅活內(nèi)源性過氧化物酶,20 分鐘,避光;

7.用 PBS 洗 2 次,每次 5 分鐘;

8.接前面實(shí)驗(yàn)步驟第六步.

四．切片的預(yù)處理：

1.洗衣粉液浸泡 30 分鐘，沖洗，晾干。

2.洗液 （含強(qiáng)酸、高錳酸鉀等）浸泡 24 小時(shí)，沖洗，晾干。

3.APES（1:50 丙酮溶液） 10-20 秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4.純丙酮 I，約 10 秒。純丙酮 II，約 5 秒

5.晾干或烤箱內(nèi)烤干，備用。