一、抗體染色方法

直接染色

直接免疫熒光染色時(shí)，細(xì)胞與直接偶聯(lián)有熒光染料（如 FITC 標(biāo)記）的抗體孵育。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于只需要一步抗體孵育，從而排除了二 抗非特異性結(jié)合的可能性。這對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色特別有用，因?yàn)榘沟拇罂贵w熒光復(fù)合物有可能被困住，造成非特異性結(jié)合甚或無法進(jìn)入細(xì) 胞，而使一抗檢測(cè)不到。

間接染色

間接染色時(shí)，一抗是沒有標(biāo)記熒光色素，而是通過帶有熒光色素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。這種二抗是對(duì)一抗具有特異性的抗體。另外可選擇使 用親和素-生物素系統(tǒng)，即使用偶聯(lián)了生物素的抗體，通過帶有熒光標(biāo)記的親和素進(jìn)行檢測(cè)。隨著目前有更多種類的偶聯(lián)二抗可以選擇，這種 方法意味著結(jié)合使用一種帶有熒光標(biāo)記的二抗，可配合針對(duì)不同目標(biāo)蛋白而沒有連接偶聯(lián)物的一抗，來進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的分析。這拓寬了研 究者對(duì)目標(biāo)蛋白的選擇。

細(xì)胞內(nèi)染色

使用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)源抗原的染色檢測(cè)成功與否，取決于各種不同的固定和通透方法，以使抗體接近細(xì)胞內(nèi)部蛋白。任何情況下， 要獲得成功的染色都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括測(cè)定抗體效價(jià)，采用合適的對(duì)照來正確設(shè)定流式細(xì)胞儀，并且優(yōu)化固定和通透步驟。

檢測(cè)分泌蛋白

檢測(cè)分泌蛋白是相對(duì)困難，是由于蛋白在檢測(cè)前就從細(xì)胞中向外分泌或者迅速降解。進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)需要使用高爾基體阻斷劑(Golgi-Block)， 例如布雷非德菌素 A (Brefaldin A)。細(xì)胞與 Brefaldin A 孵育，可以阻止蛋白從高爾基體中釋放。任何已表達(dá)而停留在高爾基體內(nèi)的蛋白，都 可以在細(xì)胞內(nèi)被檢測(cè)，使用細(xì)胞內(nèi)染色方法，便可檢測(cè)此類目標(biāo)蛋白。

二、選擇合適的熒光色素偶聯(lián)物

對(duì)一個(gè)給定的抗體，能否從陰性信號(hào)中分辨出陽性信號(hào)，往往取決于所用的熒光色素偶聯(lián)物。各種熒光色素相對(duì)強(qiáng)度的一般準(zhǔn)則是，從最亮到最暗：PE、PE-Cy7、PE-Cy5、APC > APC- Cy7、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 700 > FITC、Pacific Blue、Alexa Fluor 488。這是一般模式。在個(gè)別抗體中，這相對(duì)強(qiáng)度的模式會(huì)有差異。一個(gè)有高表達(dá)水平的抗原，幾乎使用任何一種熒光色素都能檢測(cè)出其抗原和從陰性信號(hào)中分辨出來。水平較低的抗原或需要配合使用較亮的 PE 或 APC 這類偶聯(lián)物來獲取高信背比，以便從未染色細(xì)胞中充分地分離出陽性細(xì)胞。熒光色素的相對(duì)強(qiáng)度取決于儀器。這是由于不同的儀器上的激光和濾光片的組合存在差異。切記使用合適的流式細(xì)胞儀。