用于對靶蛋白進(jìn)行檢測/染色的熒光染料被相應(yīng)激發(fā)波長的激光激發(fā)時將發(fā)出光線。那些被熒光標(biāo)記了的顆粒或細(xì)胞，可以個別檢測和分析。

自染色細(xì)胞發(fā)出的前向和側(cè)向散射光及熒光被流式細(xì)胞儀內(nèi)一套濾光片和反光鏡分成各個特定的波長并導(dǎo)向。熒光在流式細(xì)胞儀內(nèi)被過濾， 使每個傳感器檢測的熒光只屬某特定波長。這些傳感器稱為光電倍增管 (PMT)。

PMT 將光子的能量轉(zhuǎn)換成電子信號 = 電壓。

例如：

FITC 頻道 PMT 檢測 FITC 發(fā)射大約 519nm 波長的光。（它也檢測任何其他熒光色素所發(fā)射出相近波長的熒光。） PE 通道 PMT檢測 PE 發(fā)射 575nm 波長的光。（每個 PMT 會檢測任何其他熒光色素所發(fā)射出相近波長的熒光。）

下圖展示了流式細(xì)胞儀光學(xué)器件的一個例子。

BP = 帶通濾光片；DL= 雙色長通濾光片/反光鏡；

流式細(xì)胞儀采用了不同的濾光片來引導(dǎo)正確波長的光子通過每個 PMT:

帶通 (BP) 濾光片允許透射窄范圍內(nèi)波長的光子。

短通 (SP) 濾光片允許透射特定波長以下的光子。

長通 (LP) 濾光片允許透射特定波長以上的光子。

雙色濾光片/反光鏡（例如雙色 LP 長通反光鏡）安放在與光束形成 45° 角的位置。在長通雙色濾光片中，特定波長以上的光子直接透過，與 此同時特定波長以下的光子會以 90° 角反射。

信號檢測：

PMT檢測熒光細(xì)胞每次發(fā)射的光子所產(chǎn)生的電壓脈沖面積。

當(dāng)熒光細(xì)胞通過激光束時，按一段時間內(nèi)的光子數(shù)量所產(chǎn)生的峰或脈沖。它們被 PMT 檢測到并轉(zhuǎn)化為電壓脈沖。每個細(xì)胞的每個脈沖稱為 一次事件。測得的電壓脈沖面積與該事件的熒光強(qiáng)度直接相關(guān)。

1.當(dāng)沒有熒光細(xì)胞通過光學(xué)儀器時，沒有光子發(fā)射，所以檢測不到信號。

2.隨著熒光標(biāo)記細(xì)胞通過光學(xué)儀器并被激光照射，發(fā)射的光子數(shù)量增加，檢測到的電壓強(qiáng)度也相應(yīng)增加。

3.當(dāng)每個熒光細(xì)胞完成通過激光束的路程，隨著時間變化會形成一個電壓脈沖。總脈沖高度和面積會被流式細(xì)胞儀檢測。該脈沖稱為一次 事件。每次的事件將會具有特定的強(qiáng)度，具體取決于所得脈沖面積。

脈沖面積由每個脈沖時間片（取決于 ADC 的速度）的高度值加起來而確定，其中脈沖時間片為 10 兆赫，即每秒 1000 萬個脈沖或每微秒 10 個脈沖。面積更好地代表了熒光總量。

這些事件根據(jù)脈沖強(qiáng)度（脈沖面積）而分配通道。

這些信號可以藉調(diào)高流過 PMT 的電壓而被放大。

根據(jù)其測量強(qiáng)度，每個事件賦予一個頻道編號。總共有 1024 個通道。熒光越強(qiáng)，事件分配的頻道編號越大。頻道編號與事件數(shù)量的曲線圖 是單參數(shù)直方圖。通常，這些頻道都以對數(shù)標(biāo)度顯示在 x 軸上。

無染色的陰性結(jié)果

陽性結(jié)果

如觀察到陰性對照與陽性對照之間信號發(fā)生移位，此為陽性結(jié)果。 例如：ab21667 CCR2 抗人外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 抗體染色，設(shè)門于單核細(xì)胞。

數(shù)據(jù)：匿名 Abreview