1、每個(gè)泳道準(zhǔn)備 0.5 μg 小牛胸腺或酸提取的組蛋白，稀釋于加入了 100 mM DTT 的 1X LDS 樣品緩沖液中。95 °C 煮樣5 分鐘，離心。

（請(qǐng)注意，細(xì)胞裂解物的上樣量需要憑經(jīng)驗(yàn)確定。）

2、制備 10% Bis-Tris 凝膠，厚度為 1.0 mm。為了更好的分離分析組蛋白，建議使用較高百分比的凝膠 (15%)。

3、組蛋白樣品上樣，包括預(yù)染的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。于 200V 下在 MES SDS 電泳緩沖液中跑膠 35 分鐘。

在蛋白分子量較小時(shí)，染料前沿最好不要完全跑出凝膠。

4、對(duì)于轉(zhuǎn)膜，請(qǐng)參考轉(zhuǎn)膜儀器提供的實(shí)驗(yàn)方案，不同的轉(zhuǎn)膜方法（即半干或濕法）會(huì)有所不同。轉(zhuǎn)膜時(shí)間介于 30 分鐘到 90 分鐘之間；我們使用 1X 轉(zhuǎn)膜緩沖液/20% 甲醇在 30V 下轉(zhuǎn) 70 分鐘。

建議使用孔徑為 0.2 mm 的NC膜使組蛋白保留在膜上。

5、使用麗春紅染色驗(yàn)證組蛋白的成功轉(zhuǎn)膜和相等的上樣量。使用 dH2O 洗去染色。

6、在室溫 (RT) 下使用 5% BSA/0.1% TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20) 封閉 1 小時(shí)。

7、如有需要，將膜切成條帶，并按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦稀釋度在封閉緩沖液 (5% BSA/0.1% TBST) 中稀釋一抗。對(duì)于封閉肽，按照要求加入 (1 μg/mL)，置于搖床上，室溫孵育 20 分鐘。一抗室溫孵育 1.5 小時(shí)或 4 °C 過(guò)夜。

8、使用 0.1% TBST 中簡(jiǎn)單洗膜，隨后使用相同的緩沖液洗滌兩次，每次 5 分鐘，接著再洗滌兩次，每次 10 分鐘。

9、在室溫下孵育二抗 1 小時(shí) [例如 ab6721：山羊多克隆抗兔 IgG H&L (HRP)]，按照建議在 1% BSA/0.1% TBST 中進(jìn)行稀釋。

10、0.1% TBST 洗膜兩次，每次 5 分鐘，再洗滌兩次，每次 10 分鐘。

11、檢測(cè)方法示情況而定，ECL、ECF 或紅外熒光檢測(cè)。舉個(gè)例子：在膜上加 ECL 試劑室溫 3 分鐘，在不同曝光時(shí)間下捕獲WB圖像：10 秒、30 秒、1 分鐘、2 分鐘、3 分鐘、4 分鐘和 5 分鐘。

使用組蛋白抗體系列成功進(jìn)行WB的重要技巧。

使用高百分比的凝膠。

使用孔徑為 0.2 ?m 的NC膜。

封閉液使用高質(zhì)量 BSA，不要使用 Marvel 等常規(guī)奶粉。

務(wù)必使用內(nèi)參對(duì)照抗體！